Huyết Học-Truyền Máu-Miễn Dịch-Sinh Học Phân Tử Phần 2

Thứ năm - 10/09/2015 01:01
Hồng cầu lưới là giai đoạn trung gian giữa hồng cầu có nhân và hồng cầu trưởng thành. Hình ảnh mạng lưới là tàn dư của ARN riboxom được bắt màu bởi thuốc nhuộm fluorochromes. Xét nghiệm cơ bản, các trường hợp thiếu máu và đang điều trị bệnh máu.....
XÉT NGHIỆM HỒNG CẦU LƢỚI (bằng máy đếm tế bào tự động) (Reticulocyte automatic count)
 
I. NGUYÊN LÝ
Hồng cầu lưới là giai đoạn trung gian giữa hồng cầu có nhân và hồng cầu trưởng thành. Hình ảnh mạng lưới là tàn dư của ARN riboxom được bắt màu bởi thuốc nhuộm fluorochromes.
II. CHỈ ĐỊNH
- Xét nghiệm cơ bản.
- Các trường hợp thiếu máu và đang điều trị bệnh máu.
 III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
VI. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên tế bào.
 
2. Dụng cụ - Hóa chất
2.1. Dụng cụ
- Máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA;
- Máy đếm tế bào laser.
 
2.2. Hoá chất
Dung dịch thuốc nhuộm fluorochromes thương mại.
 
3. Bệnh phẩm
Là mẫu bệnh phẩm được gửi đến từ các phòng xét nghiệm hoặc các khoa lâm sàng.
4. Phiếu xét nghiệm
IV. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị mẫu
máu được lấy cho vào ống nghiệm chống đông bằng EDTA, mỗi lần phân tích máy sẽ tự động lấy 50µm.
2. Bật máy và chọn chế độ phân tích
- Bật  máy bằng nút ON (Bật) ở phía sau thân máy.
- Sau khi khởi động, máy sẽ tự động rửa từ 3 đến 5 lần, sau đó sẽ phân tích mẫu trắng.
- Chọn chế độ phân tích bằng phím MODE, chọn chế độ chạy hồng cầu lưới R, bấm phím ENTER.
- Nhập số thứ tự mẫu bấm phím SAMPLE NO (Thứ tự mẫu), nhập số thứ tự từ bàn phím, bấm ENTER (Chọn).
3. Phân tích mẫu
- Lắc đều ống nghiệm đựng mẫu khoảng 10 lần.
- Mở nắp đậy ống nghiệm.
- Đưa ống nghiệm vào kim hút và nhấn nút START (Khởi động).
- Máy sẽ hút mẫu, sau hai tiếng bíp, màn hình sẽ hiện ra dòng chữ ANALYSING (đang phân tích mẫu), khi đó rút ống nghiệm ra khỏi kim hút, máy sẽ bắt đầu phân tích.
- Khi kết thúc quá trình phân tích, trên màn hình sẽ hiện ra kết quả và máy sẽ thông báo READY (sẵn sàng) cho phân tích mẫu tiếp theo.
V. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Kết quả được hiển thị trên màn hình.
- In kết quả bằng máy in gắn sẵn.
 
VI. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Lắc không đều ống nghiệm.

XÉT NGHIỆM HỒNG CẦU LƢỚI (Bằng kỹ thuật nhuộm xanh sáng Cresyl) (Reticulocyte count by Cresyl’s stain)
 I. NGUYÊN LÝ
Hồng cầu lưới là giai đoạn trung gian giữa hồng cầu có nhân và hồng cầu trưởng thành. Hình ảnh mạng lưới là tàn dư của ARN riboxom được bắt màu bởi thuốc nhuộm đặc biệt xanh cresyl.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp thiếu máu và đang điều trị bệnh máu.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên tế bào.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Dụng cụ
- Máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA;
- Ống nghiệm khô sạch có nút;
- Tiêu bản kính, tiêu bản kéo khô, sạch;
- Pipette Pasteur;
- Tủ ấm hoặc Bain marrie;
- Kính hiển vi quang học.
 
2.2. Hoá chất
Thuốc nhuộm xanh cresyl bão hoà.
 
3. Bệnh phẩm
Là mẫu bệnh phẩm được gửi đến từ các phòng xét nghiệm hoặc các khoa lâm sàng.
4. Phiếu xét nghiệm
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Dùng pipette nhỏ 2 giọt máu vào ống nghiệm.
- Dùng pipette khác nhỏ 2 giọt thuốc nhuộm xanh cresyl bão hoà vào ống nghiệm. phút.
- Lắc đều ống nghiệm, để ống nghiệm vào Bain marrie 37°C trong 20
  - Lắc đều ống nghiệm, dùng pitpette nhỏ 1 giọt máu trên lam kính, làm tiêu bản máu đàn mỏng, để tiêu bản khô tự nhiên trong khoảng 15 đến 20 phút.
- Đặt tiêu bản lên kính hiển vi quang học, dưới vật kính dầu 100,  hồng cầu lưới bắt màu thuốc nhuộm xanh cresyl có dạng lưới mỏng màu xanh ngọc. VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Tính tỷ lệ hồng cầu lưới trên 100 hồng cầu trưởng thành.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Lắc không đều ống nghiệm khi ủ và khi làm tiêu bản.
- Thuốc nhuộm kém chất lượng.
- Đọc nhầm thể vùi.

XÉT NGHIỆM TÌM TẾ BÀO HARGRAVE
(Hargrave cell Test)
 I. NGUYÊN LÝ
Kháng  thể  kháng nhân  tự sinh trong  huyết  thanh kết hợp  với  kháng nguyên tương ứng của màng nhân tế bào, dưới tác động của bổ thể, làm tổn thương màng nhân, tạo thành khối thuần nhất. Bạch cầu trung tính thực bào phức hợp này tạo ra tế bào Hargrave.
II. CHỈ ĐỊNH
Nghi ngờ bệnh hệ thống.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 Kỹ thuật viên
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
- Bơm tiêm 3ml;
- Ống nghiệm 5ml;
- Máy lắc ống nghiệm;
- Bi nhựa nhỏ;
- Bộ dụng cụ làm tiêu bản máu đàn;
- Bộ dụng cụ và hóa chất nhuộm Giemsa;
 
3. Bệnh phẩm
Máu tĩnh mạch.
 
4. Phiếu xét nghiệm
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch (chống đông bằng heparin- 20 đơn vị/ml).
- Trộn đều, để bơm tiêm thẳng đứng quay kim lên trên trong 60 phút.
- Bẻ cong kim, bơm nhẹ nhàng một nửa phần huyết tương ra một ống nghiệm khô và sạch (ống 1). Phần lắng giữa khối hồng cầu và huyết tương được bơm ra một ống nghiệm khác, trộn đều và được chia thành hai phần: một nửa để nguyên (ống 2), còn một nửa đem lắc bi trong 15 phút (ống 3).
- Hòa lẫn ống 1, ống 2, ống 3. Lắc trộn đều  nhẹ nhàng, ủ 37oC trong 60 phút.
- Lắc đều, ly tâm nhẹ lấy cặn kéo 4 tiêu bản và nhuộm Giemsa như tiêu bản máu đàn.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Tế bào Hargrave được tạo ra do bạch cầu đoạn trung tính thực bào một nhân đang thoái hóa.
- Trên tiêu bản nhuộm Giemsa: Nhân thoái hóa là một khối thuần nhất tròn, to, màu gạch non. Các đoạn nhân của bạch cầu thực bào bị đẩy dạt ra xung quanh khối thuần  nhất tạo nên hình “ hoa hồng”. Bào tương của bạch cầu đoạn trung tính thực bào rất mờ nhạt, khó quan sát.
- Phải đọc ít nhất 2 tiêu bản mới đủ kết luận. Khi trả lời kết quả thì trả lời là có hay không tìm thấy tế bào Hargrave. Nếu có thì mỗi tiêu bản có bao nhiêu tế bào Hargrave (tính trung bình).

Xö Lý BÖNH PHÈM SINH THIÕT Vµ CHÈN §O¸N MÔ HỌC
 
 I. NGUYÊN LÝ
Là kỹ thuật làm tiêu bản và phương pháp nhuộm để phát hiện các bất thường của tổ chức hạch, lách, tñy x•¬ng giúp chẩn đoán các bệnh lý tủy xương liên quan.
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 Kỹ thuật viên hoặc cử nhân kỹ thuật chuyên khoa Huyết học - Truyền máu.
 2. Phƣơng tiện – Hóa chất
2.1 Dụng cụ
- Máy cắt tiêu bản;
- Bàn sấy 37oC;
- Kính hiển vi quang học;
- Bể nhuộm tiêu bản dung tích 100ml:       06 chiếc;
- Bể nhuộm tiêu bản dung tích 200ml:       06 chiếc;
- Giá cài tiêu bản vừa bể nhuộm 200ml: 01 chiếc;
- Giá gỗ cài tiêu bản:                              02 chiếc;
- Pipette Pasteur:                                    04 chiếc;
- Gạc thấm nước:                                    03 chiếc;
- Bút chì hoặc bút viết kính:                   01 chiếc;
- Lamen 22 x 24 hoặc 22 x 22.
 
2.2 Hóa chất
- Toluen 1,2,3: để sẵn trong 3 bể nhuộm 100ml;
- Cồn tuyệt đối Etylic 1,2,3 để sẵn trong bể nhuộm 100ml;
- Cồn 80o pha sẵn và để trong bể 100ml;
- Dung dịch Hematoxylin (thành phẩm): để sẵn trong bể 200 ml;
- Dung dịch  Erythrosin: để sẵn trong bể nhuộm 200 ml;
- Axit HCL %: Để trong bể nhuộm 200 ml;
- Boom Canada: Lấy ra cốc nhỏ, để trong tủ 60oC.
 
Cách pha hóa chất
Dung dịch Erythrosin
Erythrosin B (C20H6I4Na2O5):                   0,1g

Nước cất:                                             100ml
 
Khuấy đều ta được dung dịch Erythrosin B(C20H6I4Na2O5) nồng độ 1‰
 
Dung dịch Hematoxylin: là hóa chất thành phẩm có trên thị trường.
 
Dung dịch Hemalun demayer
Công thức:
 
- Alunde K(KAl(SO4)2.12H2O): 5g
- Hematine(C6H12O6): 300mg
- Acid Acetic(CH3COOH): 5ml
-
¨Cách pha:
Nước cất: 250ml
Đun sôi nước cho Alunde K.(KAl(SO4)2.12H2O) vào đun tiếp khoảng
1®2 phút cho tan hết, sau đó cho tiếp Hematine  (C6H12O6), đun thêm 1 phút và tắt bếp bắc ra để nguội à cho tiếp Acid Acetic (CH3COOH)  vào ta được dung dịch Hemalun demayer.
Dung dịch Na2S2O5%
-  Na2S2O3:             5g
-   Nước cất:           100ml
Lắc đều cho tan hÕt Na2S2O3 sẽ được dung dịch Na2S2O3 5%:
Dung dịch Na2CO1%
-  Na2CO3:             1g
-   Nước cất:           100ml
Trộn dung môi và chất tan lẫn nhau, sau đó lắc đều cho tan hết Na2CO3   ta
được dung dịch cần pha.
 
Dung dịch Lugol
Công thức:
¨Cách pha:
-   KI:                           2g
-   Iôt tinh thể:              1g
-   Nước cất:           100ml

 Cho KI hòa tan trong nước trước sau đó cho tiếp Iốt tinh thể vào, khuấy đều cho đến khi tan hết ta được dung dịch Lugol.

3. Bệnh phẩm
Là các tiêu bản mảnh sinh thiết đã cắt sẵn, đảm bảo khô: Sau khi mảnh sinh thiết được đúc thành khuôn, tiến hành cắt dán trên lam kính và để khô trong tủ ấm 37oC trong 3 giờ.
4. Phiếu xét nghiệm
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Quy trình xử lý bệnh phẩm sinh thiết
- Cố định mảnh sinh thiết trong dung dịch (DD) Formol 10% trong 24 giờ;
- Chuyển trong hóa chất:
+ Rửa mẫu trong nước chảy nhẹ trong 1 giờ;
+ Đẩy nước bằng ngâm trong cồn; Ngâm trong cồn 90o: 30 phút; Ngâm trong cồn tuyệt đối I: 1 giờ; Ngâm trong cồn tuyệt đối II: 1 giờ; Ngâm trong cồn tuyệt đối II: 3 giờ;
- Loại cồn bằng Xylen →lấy mảnh sinh thiết thấm khô bằng giấy thấm
Ngâm trong Xylen I: 30 phút; Ngâm trong Xylen II: 1 giờ; Ngâm trong Xylen III: 1 giờ;
- Vùi mẫu trong parapin và đúc khuôn.
Lấy mẫu từ Xylen III và thấm khô bằng giấy thấm. Ngâm trong Parafin nóng chảy trong 12 giờ.
Đúc mảnh sinh thiết trong khuôn Parafin nóng chảy.
Bảo quản khuôn mảnh sinh thiết trong ngăn tủ mát (2oC-8oC)
 
2. Nhuộm Giemsa mảnh sinh thiết
- Cắt dán tiêu bản và để khô trong tủ 37oC trong 2 giờ;
- Tẩy Parafin bằng cách chuyển mẫu qua Toluen I,II,III → cồn tuyệt đối
I,II và cồn 80oC. Mỗi loại 5 phút;
- Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ: 5 phút;
- Tráng qua cồn tuyệt đối;
- Nhuộm Giemsa 1/10: 15 phút;
- Rửa dưới nước chảy nhẹ;
- Đẩy nước bằng cồn tuyệt đối ngâm trong Toluen;
- Gắn lamen và để khô.

3. Nhuộm HE mảnh sinh thiết h¹ch, l¸ch.
- Tẩy parafin bằng cách chuyển mẫu qua Toluen I, II, III à cồn 80o, cồn
tuyệt đối I, II: Mỗi loại 5 phút;
- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
- Nhuộm trong Hematoxylin: 2 - 5 phút;
 
- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
- Tẩy qua axit HCL 1%: 4-8 giây (nếu cần);
- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
- Nhuộm trong Erythrosin: 30 - 60 giây;
- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
- Đẩy nước bằng cồn tuyệt đối ® ngâm tiêu bản trong Toluen;
 - Gắn lamen, để khô và nhận định kết quả.
 
4. Nhuộm HE mảnh sinh thiết tñy x•¬ng
- Chuyển xylen 1,2,3, cồn 1,2 và cồn 80o mỗi loại 5 phút;
- Rưả dưới dòng nước chảy 10 phút và rửa sạch paraphin;
- Nhuộm Lugol :10 phút;
- Rửa nước chảy:10 phút;
- Nhuộm Na2S2O3: 5 phút;
- Rửa dưới dòng nước chảy:10 phút;
- Nhúng vào Hemlundemaye: 4 phút;
- Rửa nước chảy:10 phút;
- Tẩy cồn HCL 1 % 8 giây;
- Rửa dưới dòng nước chảy 10 phút (nước có sẵn trong cóng);
- Làm xanh tiêu bản bằng Na2CO3 :1 phút;
- Rửa dưới dòng nước chảy:10 phút;
- Nhúng nền bằng Erythrosin: 2- 4 giây;
 - Rửa nước chảy 5 phút;
- Gắn lamen: rửa sạch tiêu bản, tráng lại bằng nước cất, tẩy nước bằng cồn tuyệt đối, nhúng qua xylen 1,2,3 (đã để trong tủ ấm) và gắn lamen.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Trên tiêu bản đẹp: thấy rõ các tế bào có đủ nhân, nguyên sinh chất và các hạt của các dòng tế bào. Bên cạnh đó thấy được hình thái và tính chất của tổ chức như lớp vỏ, lớp tủy và các đặc điểm của mỗi phần.
- Việc nhận xét hình thái tế bào và tổ chức học đòi hỏi nhân viên phải có kiến thức về Tế bào - Tổ chức học và giải phẫu bệnh. Vì vậy nhân viên làm kỹ thuật quan tâm nhiều đến việc sau khi nhuộm thì các tế bào và cấu trúc tổ chức có bắt màu tốt hay không cũng như các đặc điểm.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Nhuộm các thì hóa chất không phù hợp
- Hóa chất đã bị thay đổi nồng độ.

CHỤP ẢNH TRÊN KÍNH HIỂN VI KỸ THUẬT SỐ VÀ GHI ĐĨA
 I. NGUYÊN LÝ
Chụp ảnh tiêu bản bệnh phẩm (máu, dịch hút tủy xương, sinh thiết tủy xương, hạch, các dịch sinh học khác..) và in ra đĩa CD.
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 Kỹ thuật viên hoặc Cử nhân kỹ thuật, bác sĩ chuyên khoa Huyết học - Truyền máu.
 
2. Phƣơng tiện
- Kính hiển vi quang học có cấu hình camera và phần mềm chụp ảnh, xử lý ảnh.
- Máy tính có ổ DVD Write (DVD – RW) hoặc VCD Write
- Đĩa CD theo chỉ định
- Phần mềm ghi đĩa Nero 6.0 hoặc 7.0

3. Bệnh phẩm
Tiêu bản bệnh phẩm (máu, dịch hút tủy xương, sinh thiết tủy xương, hạch, các dịch sinh học khác..).
4. Phiếu xét nghiệm
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1 Thao tác chụp ảnh
- Bật máy tính và KHV.
- Chọn vi trường tế bào cần chụp ảnh trên KHV.
- Chỉnh nét ảnh bằng xoay nhẹ ốc vi cấp của KHV, quan sát tế bào hay vi trường
- cần chụp ảnh trên màn hình máy vi tính.
- Chọn phần mềm AXIO vision Release 4.6 trên máy tính.
- Chọn Live trên thanh công cụ của cửa sổ AXIO vision.
- Vào Propertise / Adjust  Chỉnh mức độ màu: 0,51 Cyan  - Red
0,51 Yellow - Blue
0,00  Magenta – Green
 - Chụp ảnh bằng cách vào Snap
- Chọn Prrocessing ở thanh công cụ chuẩn.
+ Vào Sharpen / Enhance Contour. Chọn Apply/ Cancel.
+ Vào Smooth / Gause/ Chọn Apply /Cancel.
+ Không lưu các ảnh: Snap và IP- Enhance Contour Image.
+ Lưu ảnh cuối cùng IP Gause Image.
- Lưu ảnh bằng cách vào File/Chọn Save as hoặc Save/ Tên BN mã số.
 
2. Thao tác ghi đĩa
- Cho đĩa vào đầu ghi
- Khởi động phần mềm Nero
- Chọn biểu tượng Data/ Make Data CD(2)
Tại cửa sổ Disc Content → chọn Å  Add sẽ xuất hiện cửa sổ để chọn nơi lưu ảnh. Chọn ảnh bằng chuột trái hoặc Clrt+A → nhấn  Add → finish hoặc Close để thoát khỏi cửa sổ chọn ảnh.
- Nhấn Next: Tại vị trí Current reccorde chọn ổ đĩa để ghi (thường là CD- R/RW). Sau đó là chọn chế độ ghi (thường là chọn 24 bit/s…)
- Nhấn biểu tượng và chữ Burn.
- Khi hoàn tất máy sẽ yêu cầu → chọn Ok → khay đĩa đẩy ra và lấy đĩa CD.
- Thoát khỏi chương trình Nero (máy sẽ hỏi có lưu hay không lưu nội dung đã ghi).
 
IV. YÊU CẦU CHẤT LƢỢNG.
Chụp được đúng tế bào, vi trường... cần chụp, ảnh rõ nét, đẹp.

CHỤP ẢNH TRÊN KÍNH HIỂN VI KỸ THUẬT SỐ
 
 I. NGUYÊN LÝ
Chụp ảnh tiêu bản bệnh phẩm (máu, dịch hút tủy xương, sinh thiết tủy xương, hạch, các dịch sinh học khác..).
II. CHUÂN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 Kỹ thuật viên hoặc Cử nhân kỹ thuật, bác sĩ chuyên khoa Huyết học -
Truyền máu.
2. Phƣơng tiện
- Kính hiển vi quang học có cấu hình camera và phần mềm chụp ảnh, xử lý ảnh.
- Máy tính, máy in màu.
3. Bệnh phẩm
Tiêu bản bệnh phẩm (máu, dịch hút tủy xương, sinh thiết tủy xương, hạch, các dịch sinh học khác..).
4. Phiếu xét nghiệm
III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Bật máy tính và KHV.
- Chọn vi trường tế bào cần chụp ảnh trên KHV.
- Chỉnh nét ảnh bằng xoay nhẹ ốc vi cấp của KHV, quan sát tế bào hay vi trường cần chụp ảnh trên màn hình máy vi tính.
- Chọn phần mềm AXIO vision Release 4.6 trên máy tính.
- Chọn Live trên thanh công cụ của cửa sổ AXIO vision.
- Vào Propertise / Adjust  Chỉnh mức độ màu: 0,51 Cyan  _         Red
0,51 Yellow _  Blue
0,00  Magenta _ Green
- Chụp ảnh bằng cách vào Snap
- Chọn Prrocessing ở thanh công cụ chuẩn.
+ Vào Sharpen / Enhance Contour. Chọn Apply/ Cancel.
+ Vào Smooth / Gause/ Chọn Apply /Cancel.
+ Không lưu các ảnh: Snap và IP- Enhance Contour Image.
+ Lưu ảnh cuối cùng IP Gause Image.
- Lưu ảnh bằng cách vào File/Chọn Save as hoặc Save/ Tên BN mã số.

IV. YÊU CẦU CHẤT LƢỢNG
Chụp được đúng tế bào, vi trường... cần chụp, ảnh rõ nét, đẹp.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Trung Phấn (2013), Kỹ thuật xét nghiệm huyết học cơ bản”, Nhà xuất bản Y học.
2. SM Lewis, BJ Bain et al (2006), Pratice Hematology”, 10th editon
 
3 . Wintrobe’s Clinical Hematology 12th Edition (2009)

CHƢƠNG II: ĐÔNG CẦM MÁU (Hemostasis)
 
 THỜI GIAN MÁU CHẢY (Bleeding Time)
(phương pháp Ivy)
  
I. NGUYÊN LÝ
 
Là thời gian từ lúc tạo vết thương chuẩn  ở vùng mặt trước cẳng tay đến khi máu ngừng chảy dưới áp suất 40mmHg trong suốt quá trình làm xét nghiệm; Đây là xét nghiệm được sử dụng để đánh giá giai đoạn cầm máu ban đầu.
 
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp nghi ngờ có bất thường giai đoạn cầm máu ban đầu: các bệnh lý về thành mạch (thiếu vitamin C…) bệnh lý về số lượng, chất lượng tiểu cầu (xuất huyết giảm tiểu cầu, von Willebrand, Glanzmann…).
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
1 kỹ thuật viên xét nghiệm.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Máy đo huyết áp;
- Kim chích chuyên dụng;
- Đồng hồ bấm giây;
- Giấy thấm;
- Bông thấm, dung dịch sát trùng (ether, cồn).
 
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Người bệnh ở tư thế nằm hoặc ngồi, thoải mái;
- Dùng máy đo huyết áp bơm và giữ ổn định áp lực ở mức 40mmHg;
- Chọn ở mặt trước trong cẳng tay vùng không có lông, không có mạch máu, tiến hành sát trùng nhẹ nhàng bằng cồn hoặc ether;
- Đợi 1- 2 phút cho dung dịch sát trùng bay hơi hết, sử dụng kim đặc chủng tạo 3 vết cắt cách nhau 2cm, có kích thước tương tự, có độ sâu khoảng
3mm. Khởi động đồng hồ bấm giây ngay khi mỗi vết thương được tạo thành;
- Cứ 30 giây 1 lần, dùng giấy thấm, thấm máu chảy ra từ vết cắt cho đến khi máu ngừng chảy; Bấm đồng hồ dừng lại, ghi thời gian máu chảy của từng vết thương.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Ghi kết quả vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm và kỹ thuật viên tiến hành xét nghiệm ký tên. 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
 
- Kích thước vết chích không đạt tiểu chuẩn: quá nông hoặc quá sâu;
 
- Động tác thấm máu từ vết chích quá mạnh gây bong nút tiểu cầu vừa mới hình thành.

NGHIỆM PHÁP DÂY THẮT (Tournique Test)
(phương pháp tăng áp)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Đánh giá sức bền của mao mạch qua các nốt xuất huyết dưới da sau khi tăng áp lực của máu bằng cách tạo ra một sự ứ đọng tĩnh mạch. Đây là một trong những xét nghiệm được sử dụng để đánh giá giai đoạn cầm máu ban đầu.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp nghi ngờ suy giảm sức bền mao mạch.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
1 kỹ thuật viên xét nghiệm.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Máy đo huyết áp;
- Đồng hồ.
 
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Kiểm tra nốt xuất huyết trên tay người bệnh (Nếu có, cần ghi rõ để phân biệt với nốt xuất huyết mới xuất hiện sau khi tiến hành kỹ thuật);
- Đo huyết áp người bệnh;
- Duy trì áp lực bằng máy đo huyết áp ở trị số trung bình giữa huyết áp tối đa và tối thiểu trong 10 phút;
- Tháo nhanh máy đo huyết áp, giơ cao tay người bệnh để máu lưu thông bình thường.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Đọc kết quả bằng cách đếm các nốt xuất huyết mới ở vùng phía dưới dải quấn đo huyết áp;
- Ghi kết quả: bình thường không có nốt xuất huyết mới. Khi có >10 nốt xuất huyết mới trên diện tích 10cm2 dấu hiệu dây thắt được gọi là dương tính và tuỳ theo số nốt xuất huyết xuất hiện mà kết quả được biểu thị (+), (++), (+++);
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm và kỹ thuật viên tiến hành xét nghiệm ký tên.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Nhầm với nốt xuất huyết cũ, do không kiểm tra hoặc kiểm tra không kỹ;
- Tạo áp lực quá cao hoặc quá thấp;
- Không đảm bảo thời gian tăng áp lực.

PHÁT HIỆN KHÁNG ĐÔNG ĐƢỜNG NGOẠI SINH
(Prothrombin time 1:1 mix)
 
I. NGUYÊN LÝ
Thời gian đông của xét nghiệm PT (prothrombin time) đánh giá đường ngoại sinh kéo dài do 2 nhóm nguyên nhân chính: thiếu hụt hoặc có chất ức chế một hoặc nhiều yếu tố đông máu tham gia con đường đông máu này. Tiến hành xét nghiệm PT với mẫu trộn huyết tương người bệnh với huyết tương bình thường theo tỷ lệ 1: 1  (PT 1:1 mix test) để phân biệt 2 nhóm nguyên nhân này: PT của mẫu trộn sẽ điều chỉnh về bình thường nếu thiếu hụt yếu tố đông máu, PT của mẫu trộn không  điều chỉnh về bình thường trong trường hợp có chất ức chế.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp kết quả xét nghiệm đánh giá đường đông máu ngoại sinh kéo dài bất thường.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên xét nghiệm; 01 bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Tủ lạnh;
- Máy ly tâm;
- Bình cách thủy 37oC/ máy đông máu bán tự động/ máy đông máu tự động;
- Đồng hồ bấm giây;
- Bơm tiêm nhựa lấy máu;
- Bông cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm tan máu kích thước 75 x 9,5mm;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Pipette 100µl;
- Đồng hồ bấm giây;
- Nước cất;
- Thromboplastin canxi;
- Huyết tương chứng.

3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên đầy đủ, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch của người bệnh và 2ml máu tĩnh mạch của chứng bình thường (nếu không có mẫu chứng thương mại);
- Trộn đều máu với chất chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh để thu huyết tương nghèo tiểu cầu bệnh và chứng;
- Tiến hành xét nghiệm PT đồng thời với 3 mẫu huyết tương trong cùng điều kiện:
+ Mẫu huyết tương chứng;
+ Mẫu huyết tương bệnh;
+ Mẫu huyết tương hỗn hợp chứng và bệnh theo tỷ lệ 1:1.
- Ghi thời gian đông của cả 3 mẫu.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
+ PT của hỗn hợp bệnh và chứng điều chỉnh về bình thường: kháng đông ngoại sinh âm tính;
+ PT của hỗn hợp bệnh và chứng không điều chỉnh về bình thường: kháng đông ngoại sinh dương tính;
- Ghi kết quả kháng đông ngoại sinh dương tính hay âm tính vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm, kỹ thuật viên tiến hành và bác sĩ nhận định kết quả xét nghiệm ký tên.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Mẫu huyết tương chứng không đảm bảo chất lượng;
- Mẫu huyết tương hỗn hợp bệnh và chứng không đảm bảo tỷ lê.
- Các mẫu kiểm tra: huyết tương bênh, chứng và huyết tương hỗn hợp bệnh và chứng không được tiến hành xét nghiệm PT cùng thời điểm, cùng hóa chất...

ĐNH LƢỢNG FIBRINOGEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIÁN TIẾP (PT- BASED ASSAYS) BẰNG MÁY BÁN TỰ ĐỘNG/TỰ ĐỘNG
 
 I. NGUYÊN LÝ
Tiến hành xét nghiệm PT mẫu máu cần kiểm tra, nồng độ fibrinogen sẽ được suy ra từ mức độ thay đổi mật độ quang so với đường cong chuẩn; Đường cong chuẩn  được thành lập dựa vào mức độ thay đổi mật độ quang học khi tiến hành xét nghiệm PT ở các nồng độ pha loãng khác nhau  của mẫu huyết tương chuẩn đã biết trước nồng độ fibrinogen.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp định lượng fibrinogen nhằm mục đích sàng lọc bất thường đông cầm máu.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên xét nghiệm.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Tủ lạnh;
- Máy ly tâm;
- Máy đông máu bán tự động/tự động;
- Pipette 100µl, 1000 µl;
- Đồng hồ bấm giây;
- Bơm tiêm nhựa lấy máu;
- Bông cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Thromboplastin canxi;
- Nước cất.
 
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Bật máy đông máu, chờ đủ nhiệt độ;
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch của người bệnh;
- Trộn máu và chất chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh thu huyết tương nghèo tiểu cầu;
- Tách lấy huyết tương cho vào cup đựng mẫu hoặc đặt trực tiếp ống máu đã ly tâm vào khay mẫu của máy (tùy theo loại máy);
- Chọn chương trình PT - Fib. trên máy đông máu;
- Chuẩn bị thromboplastin canxi theo hướng dẫn của nhà sản xuất;
- Đặt hóa chất đã chuẩn bị vào đúng vị trí ở khay hóa chất của máy;
- Tiến hành kỹ thuật theo đúng các bước được hướng dẫn trên màn hình
của từng loại máy.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Ghi kết quả vào giấy xét nghiệm.
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm và kỹ thuật viên tiến hành xét nghiệm ký
tên.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Mẫu máu bị đông, vỡ hồng cầu;
- Thromboplastin canxi không đảm bảo chất lượng.

ĐNH LƢỢNG YẾU TỐ XII (FACTOR XII ASSAY)
(phương pháp 1 thì)
 
I. NGUYÊN LÝ
Thiếu hụt yếu tố XII sẽ làm xét nghiệm APTT bị kéo dài,  APTT sẽ được
điều chỉnh khi bổ sung huyết tương có yếu tố XII và mức độ cần bổ sung  phụ thuộc nồng độ yếu tố XII có trong huyết tương cần kiểm tra. Dựa vào đó, người ta tiến hành APTT của mẫu huyết tương cần kiểm tra sau khi cho thêm huyết tương có đầy đủ các yếu tố đông máu tham gia đường đông máu nội sinh trừ yếu tố XII. Nồng độ yếu tố XII sẽ được tính dựa vào đồ thị chuẩn được thành lập với các nồng độ pha loãng khác nhau của huyết tương chứng.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp nghi ngờ thiếu hụt yếu tố XII.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện:
01 kỹ thuật viên xét nghiệm; 01 bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Tủ lạnh;
- Máy ly tâm;
- Bình cách thủy 37oC/ máy đông máu bán tự động/ máy đông máu tự động;
- Đồng hồ bấm giây;
- Pipette: 50µl,100 µl, 1.000 µl;
- Bơm kim tiêm nhựa lấy máu;
- Bông, cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm tan máu kích thước 75 x 9,5mm;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Nước cất;
- Huyết tương chứng đã biết nồng độ yếu tố XII;
- Huyết tương không có yếu tố XII;
- Canxi clorua M/40;
- Cephalin kaolin.

3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán, điều trị.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch của người bệnh và 2ml
máu tĩnh mạch của chứng bình thường (nếu không có mẫu chứng thương mại);
- Trộn đều máu với chât chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh để thu huyết tương nghèo tiểu cầu bệnh và chứng.
+ Trường hợp tiến hành bằng tay:
* Pha loãng huyết tương chứng ít nhất ở 3 nồng độ:1/10, 1/20, 1/40;
* Pha loãng huyết tương bệnh 1/10;
* Xây dựng đồ thị chuẩn: chuẩn bị 3 ống nghiệm tan máu:
(1) Mỗi ống cho vào 100 µl huyết tương chứng ở mỗi nồng độ đã pha loãng,    100 µl huyết tương không có yếu tố XII, 100 µl  hỗn dịch cephalin- kaolin;
(2) Ủ ở bình cách thuỷ 37oC trong 2 phút;
(3) Cho thêm 100 µl CaCl2 M/40;     Bấm đồng hồ, theo dõi thời gian đông.
Dựa vào thời gian đông ở các độ pha loãng, ta dựng một đồ thị trong đó trục tung là thời gian đông của các độ pha loãng, trục hoành là hoạt tính của yếu tố cần định lượng. Đồ thị sẽ là một đường thẳng.
* Xét nghiệm mẫu kiểm tra: Trong 1 ống  nghiệm tan máu chuẩn, cho vào:
(1) 100 µl huyết tương bệnh  pha loãng 1/10 và 100 µl huyết tương không có yếu tố XII, 100 µl hỗn dịch cephalin-kaolin;
(2) Ủ ở bình cách thuỷ 37oC trong 2 phút;
(3) Cho thêm 100 µl CaCl2 M/40; Bấm đồng hồ, theo dõi thời gian đông. Từ thời gian đông của mẫu huyết tương cần kiểm tra, qua đồ thị chuẩn, sẽ
tính được nồng độ yếu tố XII.

+ Trường hợp tiến hành trên máy đông máu tự động:
- Chọn chương trình tạo đồ thị chuẩn: máy sẽ tự động pha loãng và cho ra
kết quả ; Dựa vào chỉ số r để quyết định chấp nhận đồ thị này hay không.
- Tiến hành định lượng yếu tố XII của mẫu kiểm tra: chọn chương trình factor XII assay và tiến hành các bước theo hướng dẫn trên màn hình tùy từng loại máy.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Dựa vào đồ thị chuẩn để tính nồng độ yếu tố XII;
- Kết quả: ghi % hoạt tính yếu tố XII vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm, kỹ thuật viên tiến hành và bác sĩ nhận định kết quả xét nghiệm ký tên.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Mẫu máu bị đông;
- Chất lượng huyết tương không có yếu tố XII không đạt chuẩn;
- Đồ thị chuẩn không tốt.

NGHIỆM PHÁP SINH THROMBOPLASTIN
(Thromboplastin Generation Test: TGT)
 I. NGUYÊN LÝ
Sử dụng huyết tương đã được hấp phụ Al(OH)3  cung cấp các yếu tố V, VIII và  huyết thanh cung cấp các yếu tố IX,X, XI, XII cùng với sự có mặt của cephalin (yếu tố 3 tiểu cầu) để tiến hành đánh giá khả năng tạo thromboplastin nội sinh, qua đó phân biệt sự bất thường con đường đông máu nội sinh do thiếu hụt nhóm yếu tố V, VIII hay nhóm yếu tố IX, X, nhóm yếu tố XI, XII.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp bất thường đường đông máu nội sinh.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện:
01 kỹ thuật viên xét nghiệm; 01bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Tủ lạnh;
- Máy ly tâm;
- Bình cách thủy 37oC;
- Đồng hồ bấm giây;
- Pipette: 50µl,100 µl, 1.000 µl;
- Bơm kim tiêm nhựa lấy máu;
- Bông, cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm tan máu kích thước 75 x 9,5mm;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Nước muối sinh lý 0,9%;
- Đệm glyoxalin;
- Huyền dịch nhôm : Al(OH)3;
- Canxi M/40;
- Cephalin kaolin.
 
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án

Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán, điều trị.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 5ml máu người bệnh, trong đó 2ml trộn đều máu với chât chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu, ly tâm mạnh để thu huyết tương nghèo tiểu cầu;  3ml còn lại cho đều vào 2 ống thủy tinh, đặt ở bình cách thủy 37oC để thu huyết thanh;
- Garo, sát trùng , lấy khoảng 5ml máu chứng (người bình thường), trong đó 2ml trộn đều máu với chât chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ
1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu, 3ml còn lại cho đều vào 2 ống thủy tinh, đặt ở bình cách thủy 37oC để thu huyết thanh chứng;
- Sau khi ly tâm mạnh để thu huyết tương chứng nghèo tiểu cầu, tiến hành hút bởi huyền dịch nhôm;
- Mẫu huyết tương chứng sau khi hút bởi huyền dịch nhôm, được pha loãng ở nồng độ 1/5 bằng nước muối sinh lý 0,9%;
- Mẫu huyết thanh chứng được pha loãng ở nồng độ 1/10 bằng đệm
glyoxaline;
- Chuẩn bị 1 dãy các  ống nghiệm tan máu, cho sẵn 0,2 ml canxi clorua
M/40, đặt ở bình cách thủy 37oC;
- Trong 1 ống nghiệm tan máu khác, cho vào:
(1) 0,4 ml huyết tương đã hấp phụ nhôm, 0,4 ml huyết thanh, 0,4 ml
cephalin;
(2) Đặt ở bình cách thủy 37oC trong 30 giây;
(3) Cho thêm 0,4ml canxi clorua M/40, khởi động đồng hồ ngay;
(4) Ở thời điểm 50 giây, hút 0,1ml ở ống hỗn dịch trên, cho vào ống đã có sẵn 0,2ml canxi clorua M/40 đang đặt ở bình cách thủy 37oC;
(5) Ở thời điểm 60 giây, cho thêm 0,2ml huyết tương cơ chất vào ỗng vừa chuẩn bị ở bước 4, khởi động đồng hồ bấm giây, ghi thời gian đông.
Tiếp tục lặp lại bước 4 và 5 ở những khoảng thời gian nhất định.
Kỹ thuật này được thực hiện 4 lần với các thành phần sau:
 
Huyết tương   Huyết thanh
1. Bình thường + Bình thường

 
2. Bình thường + Bệnh
3. Bệnh + Bình thường
4. Bệnh + Bệnh
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Kết quả: ghi rõ bất thường đông máu nội sinh do thiếu hụt nhóm yếu tố nào: V và VIII hay IX và X hoặc XI và XII tùy theo kết quả, cụ thể:
 
Huyết tương hấp phụ Huyết thanh Kết quả Nhận định
Bình thường Bệnh Kéo dài Thiếu hụt yếu tố IX hoặc X
Bệnh Bình thường Kéo dài Thiếu hụt yếu tố V hoặc VIII
Bệnh Bệnh Kéo dài Thiếu hụt yếu tố XI hoặc XII
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm, kỹ thuật viên tiến hành và bác sĩ nhận
định kết quả xét nghiệm ký tên.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Tách huyết thanh chứng và bệnh khi ống máu đông chưa đủ thời gian để
4 giờ ở bình cách thủy 37oC;
- Huyết tương cơ chất không đảm bảo chất lượng.

ĐNH LƢỢNG ỨC CHẾ YẾU TỐ IX
(FACTOR IX INHIBITOR ASSAY)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Bằng cách trộn huyết tương người bệnh với chế phẩm yếu tố IX cô đặc đã biết trước nồng độ yếu tố IX, sau đó định lượng yếu tố IX còn lại trong chế phẩm cô đặc, sẽ biết được nồng độ ức chế có trong huyết tương cần đánh giá. Định lượng ức chế IX rất hữu ích trong điều trị cũng như theo dõi người bệnh có chất ức chế này.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp kết quả xét nghiệm định tính ức chế yếu tố IX
cho kết quả dương tính.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên xét nghiệm; 01 bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Tủ lạnh;
- Máy ly tâm;
- Bình cách thủy 37oC/ máy đông máu bán tự động/ máy đông máu bán tự động tự động;
- Đồng hồ bấm giây;
- Giấy log kép để tính nồng độ yếu tố IX (trường hợp sử dụng phương pháp thủ công);
- Bơm tiêm nhựa lấy máu;
- Bông cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm tan máu kích thước 75 x 9,5mm;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Pipette 100µl, 200µl, 1.000µl;
- Đồng hồ bấm giây;
- Nước cất;
- CaCl2 M/40;
- Cephalin - kaolin;
- Chế phẩm yếu tố IX cô đặc;
- Huyết tương không có yếu tố IX.
 
3. Ngƣời bệnh
Nhịn ăn sáng, trừ trường hợp cấp cứu.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán, điều trị…
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch của bệnh và 2ml máu
tĩnh mạch của chứng bình thường (nếu không có mẫu chứng thương mại);
- Trộn đều máu với chât chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh để thu huyết tương nghèo tiểu cầu chứng và bệnh;
- Chuẩn bị 2 ống nghiệm: 1 ống cho 0,4ml huyết tương bệnh và ống còn lại: 0,4ml huyết tương chứng;
- Cho thêm vào mỗi ống 0,1 ml chế phẩm IX cô đặc, trộn đều;
- Tiến hành kỹ thuật định lượng yếu tố IX cho 2 ống ở trên;
- Tính nồng độ yếu tố IX trong hỗn dịch huyết tương bệnh và so sánh với
mẫu huyết tương chứng.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Ghi kết quả: Ghi nồng độ ức chế IX vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm, kỹ thuật viên tiến hành và bác sĩ nhận định kết quả xét nghiệm ký tên.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Chất lượng chế phẩm yếu tố IX cô dặc không đảm bảo;
- Đồ thị chuẩn không tốt;
- Thời gian từ khi pha loãng huyết tương đến khi tiến hành kỹ thuật quá lâu.

ĐNH LƢỢNG HOẠT TÍNH PLASMINOGEN (PLASMINOGEN
ACTIVITY ASSAY)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Thiếu hụt plasminogen thường gây nên tình trạng huyết khối; Tiến hành định lượng hoạt tính  plasminogen bằng  phương pháp  sử dụng streptokinase để hoạt hóa plasminogen có mặt trong mẫu huyết tương cần kiểm tra, sau đó phức hợp plasminogen - streptokinase được phát hiện bằng cơ chất tạo màu.
II. CHỈ ĐỊNH
Những trường hợp nghi ngờ thiếu hụt plaminogen bẩm sinh hoặc mắc phải: huyết khối tĩnh mạch, điều trị thuốc tiêu cục đông, DIC...
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên xét nghiệm; 01 bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Máy đông máu có kênh so màu;
- Bơm tiêm nhựa lấy máu;
- Bông cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Pipette 100µl, 200µl, 1.000µl;
- Bộ kit định lượng hoạt tính plasminogen bao gồm: cơ chất tạo màu, streptokinase, đệm.
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán…
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Lấy 02 ml máu tĩnh mạch, trộn đều với chất chống đông citrat natri 3,2%
hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông cho 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh, thu huyết tương nghèo tiểu cầu;
- Bật máy đông máu, chờ đủ nhiệt độ;
- Chuẩn bị bộ kit định lượng hoạt tính  plasminogen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất;
- Tiến hành kỹ thuật theo các bước được hướng dẫn cụ thể tùy theo từng loại máy đông máu mà phòng xét nghiệm hiện có.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Ghi kết quả nồng độ hoạt tính plasminogen của mẫu kiểm tra và trị số bình thường vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm, kỹ thuật viên tiến hành và bác sĩ nhận định kết quả xét nghiệm ký tên.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Mẫu máu bị đông, vỡ hồng cầu;
- Garô tĩnh mạch quá lâu trước khi lấy máu xét nghiệm.

ĐO ĐỘ QUÁNH MÁU/ HUYẾT TƢƠNG
(WHOLE BLOOD/PLASMA VISCOSITY TEST)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Đo độ quánh của  máu toàn phần hoặc huyết tương bằng kỹ thuật FOR (Free Oscillation  Rheometry ), dựa vào sự thay đổi tần số và biên độ dao động tự do và  so sánh với đồ thị chuẩn để tính ra độ quánh của mẫu cần đo.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp nghi ngờ tăng độ quánh máu/huyết tương: đa hồng cầu, đa u tủy xương...
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
1 kỹ thuật viên xét nghiệm.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Garo, bông cồn sát trùng, bơm kim tiêm lấymáu;
- Ống nhựa có chât chống đông EDTA;
- Máy đo độ quánh;
- Pipet man loại 1ml, 0,5ml, 0,1ml;
- Máy ly tâm.
 
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng và lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch;
- Trộn máu với chất chống đông EDTA;
- Ly tâm 3.000v/phút trong 20 phút thu huyết tương nghèo tiểu cầu nếu đo độ quánh huyết tương;
- Bật máy đo độ quánh;
- Hút 1ml máu toàn phần nếu đo độ quánh máu, 0,6ml huyết tương nghèo tiểu cầu nếu đo độ quánh huyết tương cho vào cóng đo chuyên dụng, đặt cóng đo đã chứa mẫu đo vào buồng ủ;
- Chọn chương trình đo thích hợp với từng loại mẫu đo;
- Vào chương trình đo độ quánh thích hợp.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Ghi kết quả độ quánh đo được của mẫu cần kiểm tra và trị số bình thường vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm và kỹ thuật viên tiến hành xét nghiệm ký tên.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Mẫu máu bị đông;
- Chọn điều kiện nhiệt độ để đo độ quánh không đúng.

PHÁT HIỆN KHÁNG ĐÔNG ĐƢỜNG CHUNG
(THROMBIN TIME 1:1 MIX)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Thời gian đông của xét nghiệm thời gian thrombin (TT) kéo dài do 2 nhóm nguyên nhân chính: thiếu hụt yếu tố đông máu hoặc do có chất ức chế con đường đông máu này. Tiến hành xét nghiệm TT với mẫu trộn huyết tương người bệnh với huyết tương bình thường theo tỷ lệ 1: 1  (TT 1:1 mix test) để phân biệt
2 nhóm nguyên nhân này: TT của mẫu trộn sẽ điều chỉnh về bình thường nếu thiếu hụt yếu tố đông máu, TT của mẫu trộn không  điều chỉnh về bình thường trong trường hợp có chất ức chế.
II.CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp kết quả xét nghiệm đánh giá đường đông máu
chung (Thrombin time) kéo dài.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên; 01 bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Tủ lạnh;
- Máy ly tâm;
- Bình cách thủy 37oC/ máy đông máu bán tự động/ máy đông máu tự động;
- Đồng hồ bấm giây;
- Bơm tiêm nhựa lấy máu;
- Bông cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm tan máu kích thước 75 x 9,5mm;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Pipette 100µl, 1.000 µl;
- Thrombin pha loãng nồng độ thích hợp để tiến hành kỹ thuật thời gian thrombin.
 
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.

4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán…
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch người bệnh và 2ml máu
tĩnh mạch chứng bình thường (nếu không có mẫu chứng thương mại);
- Trộn đều máu với chất chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh để thu huyết tương nghèo tiểu cầu chứng và bệnh;
- Trộn huyết tương chứng và bệnh theo tỷ lệ 1:1;
- Tiến hành xét nghiệm TT đồng thời với 3 mẫu huyết tương trong cùng điều kiện:
+ Mẫu huyết tương chứng;
+ Mẫu huyết tương bệnh;
+ Mẫu huyết tương hỗn hợp chứng và bệnh theo tỷ lệ 1:1.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
+ TT hỗn hợp bệnh và chứng điều chỉnh về bình thường: kháng đông đường chung âm tính;
+ TT hỗn hợp bệnh và chứng không điều chỉnh: kháng đông đường chung dương tính;
- Ghi kết quả kháng đông đường chung dương tính hay âm tính vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm,  kỹ thuật viên tiến hành và bác sĩ nhận định kết quả xét nghiệm ký tên.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Mẫu huyết tương chứng không đảm bảo chất lượng;
- Mẫu huyết tương hỗn hợp bệnh và chứng không đảm bảo tỷ lê.
- Các mẫu kiểm tra: huyết tương bênh, chứng và huyết tương hỗn hợp bệnh và chứng không được tiến hành xét nghiệm TT cùng thời điểm, cùng lô hóa chất...

XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN GIẢM TIỂU CẦU DO HEPARIN
(Heparin Induced Thrombocytopenia: HIT)
  
I. NGUYÊN LÝ
Khi người bệnh được điều trị heparin, thuốc này có thể kết hợp với yếu tố
4 tiểu cầu tạo phức hợp có tính kháng nguyên và trong một số trường hợp, cơ thể người bệnh tạo kháng thể chống lại kháng nguyên này, gây nên tình trạng giảm tiểu cầu ở người bệnh và được gọi là tình trạng giảm tiểu cầu do heparin. Sử dụng kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) hoặc miễn dịch hóa phát quang (chemiluminescent testing) để phát hiện kháng thể kháng tiểu cầu do heparin.
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp nghi ngờ có tình trạng giảm tiểu cầu do heparin.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên; 01 bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Máy Acustar hoặc hệ thống ELISA;
- Tủ lạnh;
- Máy ly tâm;
- Bơm tiêm nhựa lấy máu;
- Bông cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm tan máu kích thước 75 x 9,5mm;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Pipette 100µl, 1.000 µl;
- Hóa chất sinh phẩm: HemosIL AcuStar HIT-IgG(PF4-H) và HemosIL AcuStar HIT-Ab(PF4-H) hoặc HIA IgG và HIA IgGAM ELISA.
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án

Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán…
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch người bệnh;
- Trộn đều máu với chât chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8% theo tỷ lệ 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh để thu huyết tương nghèo tiểu cầu;
- Bật máy, chờ đủ nhiệt độ;
- Đặt mẫu huyết tương cần kiểm tra vào vị trí khay mẫu;
- Đặt hóa chất sinh phẩm vào đúng vị trí trên máy;
- Tiến hành các thao tác chạy máy theo các bước theo quy định.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Đánh giá kết quả dựa vào giá trị cut off;
- Ghi kết quả vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm, kỹ thuật viên tiến hành xét nghiệm và bác sĩ nhận định kết quả xét nghiệm ký tên.

ĐNH LƢỢNG KHÁNG NGUYÊN CHẤT ỨC CHẾ HOẠT HÓA
PLASMINOGEN 1
(Plasminogen Activator Inhibitor type 1 Antigen: PAI -1 Antigen)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Các chất hoạt hóa plasminogen đóng vai trò trung tâm trong điều hòa hệ
thống tiêu sợi huyết, được kiểm soát bởi các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (plasminogen Activator Inhibitor: PAI). PAI -1 là chất ức chế sinh lý chính của t- PA (tisue type plasminogen activator) có trong huyết tương. Kháng nguyên PAI -
1 được định lượng bằng phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
II. CHỈ ĐỊNH
Tất cả những trường hợp nghi ngờ tăng hoặc giảm PAI - 1.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
01 kỹ thuật viên; 01 bác sĩ xét nghiệm Huyết học.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
- Tủ lạnh đựng hóa chất sinh phẩm;
- Máy ly tâm;
- Hệ thống ELISA;
- Bơm tiêm nhựa lấy máu;
- Bông cồn sát trùng, dây garo;
- Ống nghiệm plastic có chống đông citrat natri 3,2% hoặc 3,8%;
- Pipette 100µl, 1.000 µl;
- Sinh phẩm định lượng kháng nguyên PAI - 1 thương mại;
 
3. Ngƣời bệnh
Không cần chuẩn bị gì đặc biệt.
 
4. Hồ sơ bệnh án
Chỉ định xét nghiệm được ghi rõ trong bệnh án; Giấy chỉ định xét nghiệm ghi đầy đủ thông tin về người bệnh: họ tên, tuổi, gường bệnh, khoa phòng, chẩn đoán…

V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Garo, sát trùng, lấy khoảng 2ml máu tĩnh mạch;
- Trộn đều máu với chất chống đông citrate natri 3,2% hoặc 3,8%  theo tỷ lệ: 1 thể tích chống đông trộn với 9 thể tích máu;
- Ly tâm mạnh để thu huyết tương nghèo tiểu cầu;
- Chuẩn bị đầy đủ hóa chất sinh phẩm thương mại định lượng kháng
nguyên PAI -1;
- Tiến hành định lượng kháng nguyên PAI - 1 theo các bước được hướng dẫn.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Ghi kết quả nồng độ kháng nguyên PAI - 1của mẫu kiểm tra và giá trị bình thường (khoảng 4-40 ng/mL) vào giấy xét nghiệm;
- Điền đầy đủ ngày, tháng năm, kỹ thuật viên tiến hành xét nghiệm và bác
sĩ nhận định kết quả xét nghiệm ký tên.
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Văn Bé (1989), “Kỹ thuật đông máu, Thực hành Huyết học và Truyền máu, Nhà xuất bản Y học năm 2013, tr. 225-350.
2.  Mike  Laffan,  Richard  Manning  (2010),  “Investigation  of    Hemostasis, Practical Haematology, Churchill Livingstone,Tenth edition, pp379-440.
3. Nguyễn Ngọc Minh (1997), Cầm máu và đông máu: Kỹ thuật và ứng dụng trong lâm sàng, Nhà xuất bản Y học Hà nội năm 1997.
4. Đỗ Trung Phấn và cộng sự (2013), Kỹ thuật xét nghiệm Huyết học và Truyền máu ứng dụng trong lâm sàng (tái bản lần thứ 2), Nhà xuất bản Y học năm 2013.
5. Bạch Quốc Tuyên và cs (1978), “Các xét nghiệm đông máu, Kỹ thuật xét nghiệm Huyết học và Truyền máu,ĐHY Hà nội, tr.142-179.
6.  Wayne  L.Chandler,  Albert  R.Laspada  (2005),  Handbook  of  diagnostic
Hemostasis  and  Thrombosis  tests,  University  of  Washington,  Third  edition
2005.

CHƢƠNG III: MIỄN DỊCH-DI TRUYỀN-SINH HỌC PHÂN TỬ (DÀNH CHO CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC-TRUYỀN MÁU) Immunology genetics -Molecular biology for Hematology
 
 
ĐNH LƢỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG nDNA BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA)
(Anti –nDNA quantitative test by ELISA)
 I. NGUYÊN LÝ
Kháng nguyên nDNA được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu anti – nDNA IgG-IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym  peroxidase trong giếng phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2   và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu.
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.
- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động).
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
Kít định tính nDNA IgG/IgM gồm các thành phần sau:
- Dung dịch pha loãng mẫu;
- Dung dịch rửa;
- Chứng âm (negative control);
- Chứng dương (positive control);
- Chứng ngưỡng (cut-off calibrator);
- Các nồng độ kháng thể chuẩn (calibrator): thường có 6 nồng độ chuẩn, giá trị cụ thể của các ống nồng độ chuẩn tùy thuộc vào hãng sản xuất;
- Dung dịch cộng hợp (conjugate): 1 lọ cộng hợp gồm cả IgG và IgM
dùng để phát hiện kháng thể IgG và IgM;
- Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);
- Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA;
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh;
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng;
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết
thanh thì cần ly tâm mẫu  để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm;
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20oC). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông-tan nhiều lần.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu (cung cấp theo kít).
2. Nhỏ 100µl các nồng độ chuẩn (calibrator), mẫu chứng âm, chứng dương, các mẫu thử vào các giếng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.
3. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
5. Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) vào các giếng.
6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
8. Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.
9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
10. Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.
11. Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.
12. Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép
450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.
13. Phân tích kết quả.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Căn cứ vào nồng độ chuẩn ghi trên các ống calibrator và mật độ quang đo được (chỉ số OD), nhập số liệu vào chương trình Exel để tính nồng độ kháng thể kháng nDNA (IgG và IgM) trong các mẫu thử.
- Giá trị biện luận:  Tốt nhất phải căn cứ vào các hướng dẫn biện luận và đơn vị tính đã được chuẩn hóa chất lượng của nhà sản xuất kít. Một trong những kít nDNA tốt và phổ biến trên thị trường có thông số biện luận như sau:
+ Ngưỡng bình thường   : < 12 U/ml;
+ Ngưỡng nghi ngờ        : từ 12 – 18 U/ml;
+ Ngưỡng dương tính     : > 18 U/ml.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông;
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.
- Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính: Nếu xảy ra hiện tượng này đều không dùng được kết quả của lần xét nghiệm này. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.
Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25-30oC).
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Aesku Diagnostics GmbH. 2007.   AESKULISA nDNA instruction manual.

ĐNH LƢỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG ds-DNA BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA) (Anti –dsDNA quantitative test by ELISA)
 
 
I. NGUYÊN LÝ
Kháng nguyên dsDNA được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu anti – dsDNA IgG-IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym  peroxidase trong giếng phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2   và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện – Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu;
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;
- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động);
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất

Kít định lượng dsDNA IgG/IgM gồm các thành phần sau:
- Dung dịch pha loãng mẫu;
- Dung dịch rửa;
- Chứng âm (negative control);
- Chứng dương (positive control);
- Chứng ngưỡng (cut-off calibrator);
- Các nồng độ kháng thể chuẩn (calibrator): thường có 6 nồng độ chuẩn, giá trị cụ thể của các ống nồng độ chuẩn tùy thuộc vào hãng sản xuất;
- Dung dịch cộng hợp (conjugates): 1 lọ cộng hợp IgG và IgM dùng để phát hiện kháng thể lớp IgG và IgM;
- Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);
- Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA;
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh.
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng.
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu  để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét
nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20oC). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông-tan nhiều lần.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu.
2. Nhỏ 100µl các nồng độ chuẩn (calibrator), mẫu chứng âm, chứng dương, và các mẫu thử vào các giếng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.
3. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
5. Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) vào các giếng.
6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
8. Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.
9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
10. Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.
11. Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.
12. Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép
450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.
13. Phân tích kết quả.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Căn cứ vào nồng độ chuẩn ghi trên các ống calibrator và mật độ quang đo được (chỉ số OD), nhập số liệu vào chương trình Exel để tính nồng độ kháng thể kháng dsDNA (IgG và IgM) trong các mẫu thử.
- Giá trị biện luận:  Tốt nhất phải căn cứ vào các hướng dẫn biện luận và đơn vị tính đã được chuẩn hóa chất lượng của nhà sản xuất kít. Một trong những kít dsDNA tốt và phổ biến trên thị trường có thông số biện luận như sau:
+ Ngưỡng bình thường   : < 12 U/ml;
+ Ngưỡng nghi ngờ        : từ 12 – 18 U/ml;
+ Ngưỡng dương tính     : > 18 U/ml.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin trên giấy chỉ định và trên ống nghiệm, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.
- Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính: Nếu xảy ra hiện tượng này đều không dùng được kết quả của lần xét nghiệm này. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.
Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25-30oC).

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Aesku  Diagnostics  GmbH.  2007.  AESKULISA  dsDNA  instruction manual.