Huyết Học-Truyền Máu-Miễn Dịch-Sinh Học Phân Tử Phần 3

Thứ năm - 10/09/2015 02:07
Khi ủ với huyết thanh bệnh nhân, kháng nguyên dsDNA được phủ sẵn trên các hạt nhựa latex sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu anti dsDNA IgG và IgM người (nếu có) trong huyết thanh tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể gây phản ứng ngưng kết ..
ĐNH TÍNH KHÁNG THỂ KHÁNG dsDNA BẰNG KỸ THUẬT NGƢNG KẾT LATEX
(Anti-dsDNA test by Latex)
 
I. NGUYÊN LÝ
Khi ủ với huyết thanh bệnh nhân, kháng nguyên dsDNA được phủ sẵn trên các hạt nhựa latex sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu anti dsDNA IgG và IgM người (nếu có) trong huyết thanh tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể gây phản ứng ngưng kết hạt latex sau khi ủ. Kết quả có thể nhận định bằng mắt thường.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: giám sát, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu;
- Găng tay.
 
2.2 Hóa chất
Kít định tính dsDNA gồm các thành phần sau:
- Phiến kính đen chuyên dụng cho phản ứng ngưng kết hạt latex;
- Lọ nhỏ giọt chứng âm (negative control);
- Lọ nhỏ giọt chứng dương (positive control);
- Lọ nhỏ giọt nhũ dịch latex;
- Ống hút huyết thanhh;
- Hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh.
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng.
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu  để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét
nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20oC). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông-tan nhiều lần.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
- Nhỏ 1 giọt nhũ dịch latex vào các ô phản ứng trên phiến chuyên dụng.
- Dùng ống hút mẫu hút và nhỏ 1 giọt huyết thanh hoặc nhỏ 1 giọt chứng âm hoặc 1 giọt chứng dương vào các ô phản ứng tương ứng đã nhỏ trước 1 giọt nhũ dịch Latex.
- Dùng đầu dẹt của ống hút khuấy trộn đều nhũ dịch với phần huyết thanh vừa nhỏ, lắc nhẹ nhàng phiến và đọc kết quả sau 2 phút. Thực hiện xét nghiệm ở nhiệt độ phòng.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Bình thường kết quả âm tính. Mẫu âm tính nếu: trong vùng phản ứng trên phiến kính đen thấy huyền dịch mịn mầu trắng đục đồng nhất.
- Mẫu dương tính nếu: trong vùng phản ứng trên phiến kính đen thấy huyền dịch có hiện tượng ngưng kết thành đám lớn màu trắng đục hoặc thành các hạt nhỏ lấm tấm màu trắng đục. Mẫu dương tính chứng tỏ trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể tự miễn kháng dsDNA.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin trên giấy chỉ định và trên ống nghiệm, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.
-  Gặp phản ứng âm tính giả (chứng dương không ngưng kết) hoặc dương tính giả (chứng âm ngưng kết).
Xử trí: làm lại xét nghiệm và tuân thủ đúng các bước của quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng thí nghiệm (25-30oC). Nếu hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả vẫn tiếp diễn phải chuyển sang dùng hộp hóa chất mới, còn hạn và bảo quản đúng cách.
- Nhận định kết quả không chính xác.
Xử trí: Luôn làm chứng âm và chứng dương trong mỗi lần xét nghiệm.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
OMEGA Diagnostic (Mỹ). 2000. Avitex SLE Ref OD093/ OD043 Introduction and Intended Use.

ĐNH TÍNH KHÁNG THỂ KHÁNG NHÂN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA)
(Anti Nuclear Antibody -ANA qualitative test by ELISA)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Kháng nguyên  nhân (nuclear antigen) được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng nhân (anti nuclear antibodies) lớp IgG và IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym peroxidase trong giếng phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2  và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện – Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu;
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;
- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động);
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất

Kít định lượng ANA IgG/IgM gồm các thành phần sau:
- Dung dịch pha loãng mẫu;
- Dung dịch rửa;
- Chứng âm (negative control);
- Chứng dương (positive control);
- Chứng ngưỡng (cut-off calibrator);
- Dung dịch cộng hợp (conjugates) IgG và IgM;
- Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);
- Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA.
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh.
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng.
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu  để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét
nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20o  C)Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông-tan nhiều lần.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu.
2. Nhỏ 100µl các mẫu chứng âm, chứng dương và mẫu thử vào các giếng tương ứng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.
3. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
5. Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) IgG và IgM vào các giếng tương ứng.
6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
8. Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.
9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
10. Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.
11. Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.
12. Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép
450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.
13. Phân tích kết quả.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Căn cứ vào mật độ quang đo được ở các giếng cut-of calibrator, chứng âm, chứng dương, và các mẫu thử để nhận định kết quả xét nghiệm như sau
+ Âm tính:  ODmẫu < ODcut-off   - 10%
+ Dương tính: ODmẫu < ODcut-off   + 10%
+ Vùng xám: ODcut-off   - 10% < ODmẫu < ODcut-off   + 10%
- Giá trị biện luận:  Bình thường mẫu âm tính. Nếu mẫu dương tính chứng tỏ trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể tự miễn kháng nhân tế bào (ANA). Nếu mẫu trong khoảng nghi ngờ (vùng xám), cần xét nghiệm lại sau 1-3 tháng. VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và
trên ống máu không thống nhất, máu bị đông.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin trên giấy chỉ định và trên ống máu, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.
- Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính. Nếu xảy ra đều không dùng kết quả này được. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.
Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25-30o C).
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Aesku Diagnostics GmbH. 2007. AESKULISA ANA-8S instruction manual REF 3100.

ĐNH LƢỢNG ANTI - β2 GLYCOPROTEIN BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA) (Anti – β2 Glycoprotein quantitative test by ELISA)
 
 I. NGUYÊN LÝ
β2  GLYCOPROTEIN là một loại protein tích điện âm. Kháng thể kháng β2 GLYCOPROTEIN được cho là có ý nghĩa trong chẩn đoán hội chứng Kháng phospholipid.
Kháng nguyên  β2  GLYCOPROTEIN  được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể  đặc hiệu anti – β2  GLYCOPROTEIN IgG hoặc  IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên- Kháng thể. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti IgG hoặc  anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể . Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym peroxidase trong giếng phản ứng sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2  và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến hội chứng anti-phospholipid
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật.
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện – Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu.
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.

- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động);
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
Kít định lượng β2 GLYCOPROTEIN IgG/IgM gồm các thành phần sau:
- Dung dịch pha loãng mẫu;
- Dung dịch rửa;
- Chứng âm (negative control);
- Chứng dương (positive control);
- Chứng ngưỡng (cut-off calibrator);
- Các nồng độ kháng thể chuẩn (calibrator): thường có 6 nồng độ chuẩn, giá trị cụ thể của các ống nồng độ chuẩn tùy thuộc vào hãng sản xuất;
- Dung dịch cộng hợp (conjugate): 1 lọ cộng hợp IgG và 1 lọ cộng hợp
IgM riêng biệt dùng để phát hiện IgG hoặc IgM tương ứng;
- Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);
- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);
- Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA.
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là huyết thanh.
- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng.
- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu  để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.
- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét
nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20oC). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông-tan nhiều lần.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu.
2. Nhỏ 100µl các nồng độ chuẩn (calibrator), mẫu chứng âm, chứng dương, các mẫu thử vào các giếng trên phiến theo sơ đồ định sẵn, mỗi loại 2 giếng (1 sẽ dùng cho IgG, 1 dùng cho IgM ).
3. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.

5. Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) IgG hoặc IgM vào các giếng tương ứng.
 6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
8. Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.
9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
10. Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.
11. Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.
12. Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép
450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.
13. Phân tích kết quả.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Căn cứ vào nồng độ chuẩn ghi trên các ống calibrator và mật độ quang đo được (chỉ số OD), nhập số liệu vào chương trình Exel để tính nồng độ kháng thể kháng β2-glycoprotein (IgG hoặc IgM) trong các mẫu thử.
- Giá trị biện luận:  Tốt nhất phải căn cứ vào các hướng dẫn biện luận và đơn vị tính đã được chuẩn hóa chất lượng của nhà sản xuất kít. Một trong những kít β2-glycoprotein tốt và phổ biến trên thị trường có thông số biện luận như
sau:
 
+ Ngưỡng bình thường   : < 12 U/ml
+ Ngưỡng nghi ngờ        : Từ 12 – 18 U/ml
+ Ngưỡng dương tính     : > 18 U/ml
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin trên giấy chỉ định và trên ống máu, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.
- Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính:         Nếu xẩy ra hiện tượng này đều không dùng được kết quả lần xét nghiệm đó. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.
Xử trí: thực hiện lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25-30oC).
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Aesku Diagnostics GmbH. 2007.  AESKULISA Beta2- Glycoprotein GM
instruction manual.

ĐẾM TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU CD34+ BẰNG MÁY PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY (FLOW CYTOMETER)
(Hematopoietic stem cell CD34+ enumeration test by flow cytometry)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Tế bào gốc tạo máu có kháng nguyên CD34 trên bề mặt. Nếu ủ kháng thể anti CD34 với mẫu bệnh phẩm có tế bào gốc tạo máu, kháng thể này sẽ gắn đặc hiệu lên bề mặt các tế bào gốc tạo máu mang CD34. Dùng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang phân tích trên máy phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometer) có thể đếm chính xác số lượng và tỷ lệ % tế bào gốc tạo máu CD34 trong mẫu bệnh phẩm.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp cần đếm số lượng tế bào gốc tạo máu CD34+.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Máy phân tích tế bào dòng chảy (có thể phân tích các kênh màu huỳnh quang 7ADD, FITC và PE).
- Máy ly tâm ống máu.
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
- Bộ kít đếm CD34 gồm có các hóa chất sau: 7AAD, CD45-FITC/CD34- PE, CD45-FITC/Isotype Control-PE, hạt tham chiếu (có nồng độ xác định), dung dịch ly giải hồng cầu.
- Các dung dịch chạy máy và dung dịch rửa máy để vận hành máy phân tích tế bào dòng chảy;
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Bệnh phẩm

Bệnh phẩm có thể là mẫu máu ngoại vi, mẫu máu cuống rốn, mẫu lấy từ khối tế bào gốc máu ngoại vi tươi hoặc khối tế bào gốc máu ngoại vi đông lạnh sau rã đông, hoặc mẫu dịch hút tủy xương.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- Lấy tối thiểu 0,5 ml mẫu bệnh phẩm. Nếu mẫu bệnh phẩm là máu ngoại vi thì chống đông bằng EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid). Mẫu bệnh phẩm đảm bảo chất lượng là mẫu bệnh phẩm không đông vón và không lâu quá
1 giờ sau khi lấy khỏi tĩnh mạch hoặc sau khi rã đông.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
- Đếm số lượng bạch cầu có trong mẫu thử, pha loãng mẫu thử về nồng độ
10×109 tế bào/lít, ghi lại hệ số pha loãng (số lần pha loãng).
- Lấy 100 ul mẫu thử đã pha loãng cho vào các ống 1, 2 và 3.
- Thêm 20 µl 7AAD vào cả 3 ống 1, 2, 3.
- Thêm 20 µl CD45-FITC/CD34-PE vào ống 1 và ống 2.
- Thêm 20 µl Control (CD45-FITC/Isotype PE) vào ống số 3.
- Votex đều các ống và ủ nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng.
- Thêm 2000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng 10 phút.
- Ngay lập tức thêm 100 ul huyền dịch hạt tham chiếu vào các ống 1, 2, 3.
- Trộn lắc đều các ống.
- Phân tích flow cytometry bằng chương trình đếm CD34 có sẵn trên máy
flow cytometry.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Đọc kết quả
Kết quả do chương trình máy tính tự động xuất ra dưới dạng chỉ số
CD34%, số đếm CD34 tuyệt đối (tế bào/ µl).
 
2. Nhận định kết quả
Nếu kết quả thu được giữa ống 1 và ống 2 khác nhau dưới hoặc bằng 10% thì kết quả chấp nhận tốt. Nếu khác biệt trên 10% cần phải làm lại xét nghiệm, phải chú ý thực hiện thật tốt kỹ thuật hút mẫu và hút hóa chất bằng pipet.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Đặt nhầm vị trí giữa mẫu chứng âm (Isotype Control) với các mẫu thử. Xử trí: kiểm tra đối chiếu vị trí đặt ống đúng thứ tự trước khi phân tích
- Máy chỉ cho ra kết quả CD34%, không tính ra được kết quả tế bào
CD34/ µl. Thường do quên không nhập trị số nồng độ hạt tham chiếu vào phần mềm.
Xử trí: Chạy máy phân tích lại (không cần ủ lại mẫu), kiểm tra xác định đã nhập trị số nồng độ hạt tham chiếu trước khi phân tích trên máy.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Beckman Coulter. 2011. Haematopoietic Stem Cell CD34+ Enumeration Kit
Instruction Manual.

ĐỌ CHÉO TRONG GHÉP BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY (FLOW CYTOMETRY)
(Flow cytometry Lympho Cross-match test)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Bệnh nhân có thể đã mẫn cảm với các kháng nguyên hệ HLA đồng loài từ trước  hoặc bị mẫn cảm với kháng nguyên hệ HLA trong quá trình điều trị trước ghép đồng loài (ghép tạng hoặc ghép tế bào gốc tạo máu). Khi đó trong máu bệnh nhân có thể sẽ hình thành các kháng thể miễn dịch đặc hiệu chống lại HLA đã mẫn cảm. Nếu trong máu bệnh nhân ghép có kháng thể đặc hiệu chống lại HLA người cho thì kết quả sau ghép rất xấu, thường bị thải ghép tối cấp. Để tránh tình trạng thải ghép tối cấp, trước khi ghép cần làm xét nghiệm đọ chéo nhằm phát hiện trong máu bệnh nhân dự kiến ghép có kháng thể đặc hiệu kháng lại HLA người cho hay không. Kháng nguyên hệ HLA có 2 lớp, HLA lớp 1 và HLA lớp 2. HLA lớp 1 xuất hiện trên bề mặt tất cả các tế bào có nhân, HLA lớp
2 có mặt chủ yếu trên các tế bào lympho B, tế bào mono, và tế bào tua gai (dendritic cell). Do vậy nếu ủ huyết thanh bệnh nhân (người nhận) với lympho người cho, kháng thể đặc hiệu HLA lớp 1 và/hoặc lớp 2 (nếu có) sẽ gắn lên bề mặt tế bào lympho (lympho T và/hoặc lympho B) người cho. Xét nghiệm đọ chéo lympho dùng để phát hiện kháng thể kháng HLA của người nhận ghép trong lựa chọn người cho, trong theo dõi phản ứng sau ghép. Để xét nghiệm đọ chéo lympho  trước kia người ta hay dùng kỹ thuật vi độc tế bào lympho. Tuy nhiên hiện nay do tính ưu việt về độ nhạy, độ chính xác, và tốc độ phân tích, kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy được dùng nhiều hơn.
II. CHỈ ĐỊNH
Bệnh nhân trước ghép và sau ghép tạng, ghép tủy.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
 2. Phƣơng tiện - Hóa chất

2.1. Phương tiện
- Máy phân tích tế bào dòng chảy (4 màu huỳnh quang trở lên);
- Máy ly tâm ống máu;
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;
- Các ống vi ly tâm (ống Eppendorf)1,5 ml.
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
- Dung dịch đệm PBS;
- Hỗn hợp kháng thể CD45/CD3/CD19/anti Human IgG, mỗi loại kháng thể gắn 1 màu huỳnh quang khác nhau;
- Dung dịch ly giải hồng cầu;
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Bệnh phẩm
Bệnh phẩm cần lấy là mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và của người cho.
 
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 2 ml máu chống đông bằng EDTA của người cho.
- Lấy 2 ml máu đông của bệnh nhân và 2 ml máu đông của người cho.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
- Chuẩn bị tế bào người cho:
+ Lấy 100 µl máu toàn phần người cho vào mỗi ống vi ly tâm 1,5 ml (cần làm 2 ống).
+ Thêm 1000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng 10 phút.
+ Ly tâm 3000 vòng/phút x 3 phút, đổ bỏ dịch nổi, giữ cặn tế bào.
+ Thêm 1 ml dung dịch PBS, tái huyền dịch cặn tế bào, ly tâm rửa 3000 vòng/phút x 3 phút, đổ bỏ dịch nổi
- Chuẩn bị huyết thanh bệnh nhân và huyết thanh người cho: ly tâm ống máu đông, tách huyết thanh.
- Ủ huyết thanh bệnh nhân hoặc huyết thanh người cho với tế bào người cho.
+ Nhỏ 100 µl huyết thanh bệnh nhân hoặc huyết thanh người cho vào các ống Eppendorf chứa tế bào người cho.  Trộn đều và ủ 37oC trong 1 giờ. Ống ủ huyết thành bệnh nhân với tế bào người cho là ống thử phát hiện kháng thể kháng HLA, ống ủ huyết thanh người cho với tế bào người cho là ống tự chứng.
+ Thêm 1 ml PBS, trộn đều trong 15 giây. Ly tâm 3000 vòng/phút x 3 phút. Hút bỏ dịch nổi. Lặp lại quy trình trên 2 lần
- Ủ kháng thể: Nhỏ 20 µl hỗn hợp kháng thể anti CD45/anti CD3/anti
CD19/anti human IgG, ủ 20 phút nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
- Phân tích: Phân tích flow cytometry bằng chương trình Cross match đã lập sẵn trên máy flow cytometry.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Đọc kết quả
Đọc kết quả ở các vùng lympho T và lympho B. Kết quả âm tính khi quần thể tế bào cần phân tích nằm trong vùng âm tính. Kết quả dương tính khi quần thể tế bào phân tích nằm trong vùng dương tính, có thể biểu hiện kết quả bằng tỷ lệ % quần thể phân tích nằm trong vùng dương tính.
2. Nhận định kết quả
Bình thường: đọ chéo lympho B và lympho T đều  âm tính.
Có kháng thể thường trực kháng lympho người cho: đọ chéo lympho B
dương tính và/hoặc đọ chéo lympho T dương tính.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Các vùng tế bào lympho không nằm trong cửa sổ chương trình chạy. Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy…
Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Harmer A.W., Garner S., Bell A.E. et al. 1996. Evaluation of the flow cytometric crossmatch. Preliminary results of a multicentre study. Transplantation 61, 1108-11.
2.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45 Used manual

3.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD3 Used manual
4.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD19 Used manual
5.  Beckman Coulter. 2011. IOTest Human IgG Used manual

ĐẾM TẾ BÀO LYMPHO T-CD3, T-CD4, T-CD8 BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY
(Lympho T-CD3, -CD4, -CD8 enumeration by flow cytometry)
 
 I. NGUYÊN LÝ
CD3 là kháng nguyên lympho T chung. CD3 có trên bề mặt tất cả các tế bào lympho T. Kháng nguyên CD4 có trên bề mặt tế bào lympho T hỗ trợ, tế bào mono, và một số bạch cầu hạt hoạt hóa. Kháng nguyên CD8 có trên bề mặt các tế bào lympho T gây độc và lympho T ức chế.  Do vậy, sử dụng kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy dùng các kháng thể đơn dòng kháng CD3, CD4, CD8 có gắn màu huỳnh quang khác nhau có thể đồng thời phát hiện và xác định chính xác các dấu ấn trên bề mặt các tế bào lympho  cũng như có thể đếm được tỷ lệ phần trăm và số lượng tuyệt đối các tế bào lympho T-CD3, T-CD4, và T- CD8 trong mẫu bệnh phẩm.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp cần đánh giá tình trạng miễn dịch tế bào, cần đếm CD3, 4, 8.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Máy phân tích tế bào dòng chảy (4 màu huỳnh quang trở lên);
- Máy ly tâm ống máu;
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;
- Ống nghiệm chuyên dụng cho phân tích trên máy đếm tế bào dòng chảy;
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
- Dung dịch đệm PBS;
-  Kháng  thể  đơn  dòng  kháng  CD45-PC5,  CD3-ECD,  CD4-PE,  CD8-FITC;
- Hạt Flow count;
- Dung dịch ly giải hồng cầu.
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite,
 
3. Bệnh phẩm
Là mẫu máu ngoại vi của người bệnh.
 
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
- Lấy 100  µl máu ngoại vi chống đông cho vào 1 ống phân tích tế bào dòng chảy đã ghi tên người bệnh.
- Thêm 20 µl mỗi loại kháng thể CD45-PC5, CD3-ECD, CD4-PE, CD8- FITC.
 - Trộn đều, ủ nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng.
- Thêm 2000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút.
 - Ngay sau khi kết thúc bước ủ trên, thêm 100 µl huyền dịch hạt tham chiếu, trộn đều và đem phân tích trên máy phân tích tế bào dòng chảy.
- Phân tích bằng chương trình đếm T-CD3_T-CD4_T-CD8 có sẵn trên máy phân tích tế bào dòng chảy (lưu ý nhập liệu số lượng bạch cầu có trong mẫu và nồng độ hạt tham chiếu).
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Đọc kết quả
Kết quả do chương trình máy tính tự động xuất ra dưới dạng số lượng tuyệt đối T-CD3, T-CD4, T-CD8 và tỷ lệ % T-CD3, T-CD4, T-CD8.
2. Nhận định kết quả
- Lưu ý số lượng tuyệt đối và tỷ lệ T-CD4 được lấy từ quần thể tế bào lympho có CD3+CD4+, số lượng tuyệt đối và tỷ lệ T-CD8 được lấy từ quần thể tế bào lympho có CD3+CD8+.
- Bình thường:      T-CD3:       800-2300 tế bào/uL        (55-80%) T-CD4:         400-1300 tế bào/uL                         (35-55%) T-CD8: 250-800 tế bào/uL                                    (20-35%)
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Các vùng tế bào lympho không nằm trong cửa sổ chương trình chạy. Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy…
Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.
- Chỉ ra kết quả tỷ lệ % T-CD3, T-CD4, T-CD8 mà không có số lượng tuyệt đối T-CD3, T-CD4, T-CD8. Thường do quên không nhập thông số về số lượng bạch cầu trong mẫu và nồng độ hạt tham chiếu.
Xử trí: Phân tích lại ống mẫu đã ủ. Lưu ý nhập thông số về số lượng bạch cầu trong mẫu và nồng độ hạt tham chiếu.
  
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45-PC5 Used manual.
2.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD3-ECD Used manual.
3.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD4-PE Used manual.
4.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD8-FITC Used manual.

XÉT NGHIỆM CD55/CD59 BẠCH CẦU
 
(White blood cell CD55/CD59 analysis by flow cytometry)
I. NGUYÊN LÝ
- Đái huyết sắc tố kích phát ban đêm là một bệnh rối loạn tế bào gốc tạo máu. Đột biến xảy ra ở tế bào gốc tạo máu làm mất gen GPI-A, gen này tổng hợp protein gắn màng glycosyl-phosphatidylinositol (GPI). Do mất hoặc thiếu hụt các GPI nên các protein gắn màng (như CD55, CD59) gắn ít hoặc không gắn được lên màng tế bào hồng cầu do vậy không bảo vệ được tế bào trước sự tấn công của bổ thể, dẫn tới các tế bào hồng cầu dễ bị hoạt hóa bởi bổ thể và gây vỡ hồng cầu.
- Trên phân tích tế bào dòng chảy, tế bào máu ngoại vi ủ với anti CD45 sau ly giải hồng cầu sẽ phân bổ thành 3 vùng quần thể rõ rệt: vùng bạch cầu hạt, vùng mono, và vùng lympho.
- Dựa trên các đặc tính này, kỹ thuật flow cytometry sử dụng các kháng thể đặc hiệu  gắn huỳnh quang để phát hiện sự có mặt, thiếu hụt, hoặc mất các thụ thể CD55 và/hoặc CD59 trên các quần thể tế bào bạch cầu. Từ đó góp phần chẩn đoán xác định bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.
II. CHỈ ĐỊNH
Suy tủy xương, nghĩ đến bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất.
2.1. Phương tiện
- Máy phân tích tế bào dòng chảy (máy flow cytometer);
- Máy ly tâm;
- Máy lắc trộn;
- Pipet man và đầu pipet loại 250 µl và 1000 µl;
- Ống nghiệm flow cytometry (chuyên dụng cho máy phân tích tế bào dòng chảy).
- Găng tay.

2.2. Hóa chất
- Anti CD45-PC5;
- Anti CD55-PE;
- Anti CD59-FITC;
- Dung dịch ly giải hồng cầu;
- Dung dịch sheath chạy máy flow;
- Dung dịch đệm PBS.
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Bệnh phẩm
- Là mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. Mẫu được lấy từ các người bệnh nghi ngờ đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm và người bệnh có hội chứng rối loạn sinh tủy.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- 2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA;
- Mẫu cần được ủ kháng thể ngay trong vòng 6 giờ sau lấy mẫu.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị mẫu
- Lấy 100 µl máu cho vào 1 ống nghiệm flow cytometry.
- Ly giải hồng cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng
trong 10 phút.
- Ly tâm rửa huyền dịch tế bào sau ly giải hồng cầu 2 lần, mỗi làn làm như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc  đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng dịch còn lại (khoảng 100 µl). Trộn đều cặn và lượng dịch còn lại.
2.2. Ủ kháng thể
- Cho kháng thể anti CD45-PC5, anti CD55-PE, anti CD59-FITC (mỗi loại 20 ml) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá hồng cầu ở bước trên. Trộn đều và ủ nhiệt độ phòng 20 phút, tránh ánh sáng.
- Rửa bỏ kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút.  Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào.
- Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng
cho phân tích.

2.3. Phân tích CD55, CD59 bạch cầu trên máy flow cytometry
- Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.
- Mở chương trình phân tích CD55, CD59 bạch cầu đã lập sẵn trên máy. Nhập vị trí ống phân tích và chạy chương trình phần mềm phân tích.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Chủ yếu quan sát phân tích trên quần thể bạch cầu mono và bạch cầu hạt, vùng bạch cầu lympho không thấy rõ sự biến đổi.
- Nếu mức độ dương tính CD55 và/hoặc CD59 của quần thể bạch cầu hạt và bạch cầu mono nằm trong giới hạn bình thường (dương tính >95%): không có thiếu hụt hoặc mất CD55, CD59 bạch cầu.
- Nếu mức độ dương tính CD55 và/hoặc CD59 của quần thể bạch cầu hạt và bạch cầu mono thấp ≤ 95%  (dương tính ≤ 95%):  có thiếu hụt và mất CD55 và/hoặc CD59 bạch cầu.  Đây là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh Đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.
Bình thường: Không có thiếu hụt CD55 và/hoặc CD59 ở các quần thể bạch cầu hạt và mono (CD55/CD59 bạch cầu dương tính >95%).
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương trình chạy. Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy…
Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45-PC5 Used manual.
2.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD55-PE Used manual.
3.  Beckman Coulter. 2011. IOTest CD59-FITC Used manual.

ĐIỆN DI HUYẾT SẮC TỐ TRÊN MÁY ĐIỆN DI MAO QUẢN
(Hemoglobin analysis by cappilary electrophoresis)
 
 I. NGUYÊN LÝ
Trong môi trường pH kiềm, các phân tử huyết sắc tố (hemoglobine) tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương dưới tác dụng của dòng điện 1 chiều. Quá trình điện di sẽ làm phân tách chúng thành các thành phần khác nhau dựa trên điện tích của chúng.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghi ngờ bệnh lý huyết sắc tố
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Máy điện di mao quản (ví dụ như máy Capilarys 2 hoặc máy Minicap của Sebia, Pháp);
- Giá để mẫu (đi theo máy);
- Máy ly tâm ống máu;
- Que thủy tinh.
- Găng tay, giấy thấm.
 
2.2. Hóa chất
- Dung dịch đệm (đi theo máy);
- Dung dịch rửa (đi theo máy);
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Bệnh phẩm
Là mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
 
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1.  Lấy bệnh phẩm

- Lấy 2ml máu toàn phần vào ống có chứa chất chống đông EDTA, ghi rõ thông tin người bệnh: tên, tuổi, số giường, khoa phòng, đúng với thông tin trên phiếu chỉ định.
- Mẫu máu dùng cho xét nghiệm có thể bảo quản 7 ngày ở nhiệt độ 2-8oC.
 
2.  Khởi động máy điện di mao quản
- Bật máy tính và máy máy điện di mao quản, chọn chương trình điều khiển máy điện di mao quản.
- Chọn chương trình điện di hemoglobin trong phần mềm.
- Đặt khay hóa chất điện di hemoglobin vào vị trí khay hóa chất trên máy điện di.
- Đổ dịch trong bình nước thải; Lắp các bình dung dịch rửa và bình dung
dịch đệm vào vị trí khay dịch rửa và khay dung dịch đệm.
- Trong phần mềm điều khiển máy và phân tích mẫu, nhập thông tin bệnh nhân tương ứng với từng mẫu.
3.  Chạy điện di
- Đặt ống mẫu bệnh phẩm vào các vị trí trên giá nạp bệnh phẩm tương ứng với các vị trí phân tích đã quy định khi nhập thông tin bệnh nhân vào phần mềm.
- Bấm nút phân tích trong phần mềm để máy tự động phân tích ghi nhận kết quả chạy máy.
- Sau khi máy kết thúc phân tích, dùng phần mềm kiểm tra thông tin và kết quả tương ứng của từng bệnh nhân. Lựa chọn bệnh nhân cần in kết quả, bấm nút in để in kết quả của bệnh nhân đó.
4.  Rửa máy
- Thay thế bình dung dịch đệm bằng bằng bình nước cất để rửa máy.
- Bấm nút rửa máy trên phần mềm để máy tự động rửa.
 
5.  Tắt máy
Sau khi kết thúc quy trình rửa máy, tiến hành tắt phần mềm điều khiển máy, tắt máy tính và tắt máy điện di mao quản.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sau khi phân tích máy sẽ cho ra kết quả là các loại hemoglobin phân tích được và tỷ lệ % của các hemoglobin (Hb) này. Bình thường thành phần huyết sắc tố ở người trưởng thành có: HbA1 (> 96%), HbA2(< = 4%). Ở trẻ em dưới 1 tuổi có thêm HbF (<1%). Khi có rối loạn tổng hợp hemoglobin có thể thấy tăng,

giảm hoặc mất một vài thành phần huyết sắc tố bình thường; cũng có thể kết hợp với xuất hiện các thành phần huyết sắc tố mới (ví dụ HbH, HbE…).
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót về hóa chất: khay hóa chất bị khô hoặc có bọt khí.
Xử trí: phải kiểm tra kỹ hóa chất trước khi chạy máy, nếu hóa chất không đủ phải thay khay hóa chất khác, nếu hóa chất trong khay có bọt phải loại hết bọt khí mới được dùng.
- Sai sót do nhập vào máy không đúng thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: kiểm tra đối chiếu thông tin bệnh nhân và thứ thự mẫu phân tích trước khi chạy máy.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
SEBIA. 2006. Capillarys 2 instruction manual (Ref. 1222)

SỨC BỀN HỒNG CẦU
 
(Erythrocyte Osmotic Fragility test)
 
I. NGUYÊN LÝ
Sức bền hồng cầu là sức chịu đựng của hồng cầu dưới tác dụng làm tan máu của các dung dịch muối khi hạ thấp dần nồng độ. Sức bền hồng cầu phụ thuộc vào tính thấm của màng hồng cầu.
Màng hồng cầu là màng màng bán thấm, do vậy khi cho hồng cầu vào dung dịch nhược trương, nước sẽ từ ngoài vào trong hồng cầu để cân bằng áp lực thẩm thấu, làm trương to hồng cầu. Dung dịch càng nhược trương nước sẽ vào càng nhiều và hồng cầu càng dễ vỡ. Lợi dụng tính chất đó người ta cho hồng cầu vào một loạt các dung dịch nhược trương có nồng độ khác nhau, ở pH = 7,4 để ở nhiệt độ phòng xét nghiệm. Sau một thời gian nhất định quan sát mức độ tan của hồng cầu để đánh giá tính bền vững của màng hồng cầu.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến bệnh lý huyết sắc tố, bệnh thiếu máu tan máu.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
II. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy ly tâm ống máu;
- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;
- Các ống nghiệm thủy tinh loại 5 ml;
- Nền trắng bằng giấy hoặc nhựa đục.
- Găng tay, giấy thấm.
 
2.2. Hóa chất
Dung dịch muối đệm với các nồng độ khác nhau. Cách pha như sau:
- Chuẩn bị dung dịch mẹ là một dung dịch đệm muối chloride có áp lực thẩm thấu tương đương với 100g/l (1,71 mol/l) NaCl như sau: hòa tan trong nước 90 gram NaCl; 13,65g Na2HPO4  và 2,34g NaH2PO4.2H2O và điều chỉnh thể tích về 1 lít. Dung dịch mẹ này dùng trong 1 tháng, bảo quản lạnh 4 độ C

(trong quá trình bảo quản lạnh có thể xuất hiện kết tinh thể trong lọ dung dịch. Khi đó phải để dung dịch mẹ ra nhiệt độ phòng và hòa tan tinh thể trước khi dùng).
- Từ dung dịch mẹ này trước hết pha loãng 10 lần với nước cất thành dung dịch 10%o (10g/l), sau đó từ dung dịch này pha loãng thành các dung dịch muối ở các nồng độ thấp hơn: 7%o, 6%o, 5.5%o, 5.0%o, 4.75%o,   4.5%o, 4.25%o,
4.0%o, 3.75%o, 3.5%o, 3.25%o, 3%o, 2.75%o, 2.5%o, 2%o, 1%o.
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 3. Bệnh phẩm
Là mẫu máu ngoại vi của các đối tượng người bệnh bị bệnh máu và có chỉ định của lâm sàng.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- Lấy 3ml máu tĩnh mạch, chống đông bằng Heparin (không nên dùng chất chống đông EDTA, Citrate hoặc Oxalate vì như vậy là cho thêm muối vào môi trường làm thay đổi áp lực thẩm thấu).
- Nếu bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng, cần làm xét nghiệm trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu. Nếu bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4 độ C, có thể làm xét nghiệm trong vòng 6 giờ kể từ khi lấy máu.
2. Tiến hành kỹ thuật
- Lấy 16 ống nghiệm thuỷ tinh loại 5ml xếp vào giá, ghi tên tuổi người bệnh, đánh số thứ tự từ 1 đến 16.
- Cho lần lượt 3ml dung dịch nhược trương với các nồng độ lần lượt từ
1%o đến 7%o vào 16 ống.
- Đảo nhẹ nhàng ống máu vài lần để trộn kỹ máu trong ống. Nhỏ 100 µl máu đã trộn vào mỗi ống dung dịch nhược trương.
- Lấy bông không thấm nước bịt ống nghiệm, nhẹ nhàng đảo ống vài lần để trộn đều máu và dung dịch trong ống.
- Để các ống nghiệm thẳng đứng trên giá ở nhiệt độ phòng từ 1-2 giờ, sau đó đọc kết quả tan máu tại các ống.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Đọc kết quả
- Bắt đầu tan: là nồng độ muối tại ống mà khi quan sát thấy phần dịch nổi ở ống đấy chuyển sang mầu hồng, ở đáy ống nhìn thấy cúc hồng cầu.

- Tan hoàn toàn: là nồng độ muối tại ống mà khi quan sát thấy phần dịch nổi ở ống đấy có mầu đỏ trong suốt và không còn nhìn thấy cúc hồng cầu ở đáy ống.
2. Nhận định kết quả
Bình thường:                 Bắt đầu tan từ: 4,5-5‰; Tan hoàn toàn từ: 3-3,5‰
Sức bền hồng cầu tăng:  Bắt đầu tan từ: <4,5‰;
Tan hoàn toàn từ: <3‰ Sức bền hồng cầu giảm:  Bắt đầu tan từ: >5‰;
Tan hoàn toàn từ >3,5‰
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Sai sót trong quá trình nhận định kết quả.
Xử trí: Kiểm tra cẩn thận, nếu cần thiết phải đọc màu dịch nổi trên nền giấy trắng.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dacie J. V., Lewis S. M. Osmotic fracgility, as measured by lysis in hypotonic saline. In “Practical Haematology”. Longman, 1994; 8th Edition: 216-
20.
 
2. Laboratory Network. Haemophilia 2005; 11:387-97.

TIỀN MẪN CẢM
BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN (ELISA)
(Panel reactive antibody test by ELISA)
 
I. NGUYÊN LÝ
Kháng thể kháng HLA có thể hình thành trong cơ thể người bệnh do đã được tiếp xúc với kháng nguyên trước.
Huyết thanh của người bệnh được ủ với một phiến phản ứng gồm nhiều giếng, các giếng đó được phủ các loại kháng nguyên hệ HLA khác nhau. Nếu có phản ứng kháng nguyên-kháng thể đặc hiệu xảy ra, kháng thể đó sẽ được phát hiện bằng hệ thống kháng thể thứ hai kháng IgG người vì hệ thống phát hiện bao gồm có cơ chất tạo màu và enzym xúc tác (theo nguyên lý ELISA). Nếu phản ứng tạo màu xảy ra ở giếng nào (có màu xuất hiện) thì chứng tỏ trong huyết thanh người bệnh có kháng thể đặc hiệu phản ứng với một hoặc một vài kháng nguyên có trong giếng đó. Xét nghiệm này thường được chỉ định để phát hiện kháng thể kháng HLA bất thường trước ghép, hoặc để kiểm tra đánh giá sự hình thành của kháng thể kháng HLA sau ghép.
II. CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp chuẩn bị ghép đồng loại.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên và cử nhân xét nghiệm được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
- Bác sĩ: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Máy đọc ELISA vi giếng (đọc được phiến Terasaki);
- Bộ pipet man 10, 20, 200, và 1000 µl;
- Máy ly tâm ống máu;
- Que thủy tinh.
- Găng tay, giấy thấm.
 
2.2. Hóa chất
- Bộ kít tiền mẫn cảm bao gồm:
+ Dung dịch rửa;

+ Dung dịch pha loãng mẫu;
+ Huyết thanh chứng dương;
+ Dung dịch cộng hợp;
+ Dung dịch cơ chất tạo màu;
+ Dung dịch ngưng phản ứng;
+ Phiến nhựa vi giếng có gắn sẵn các hỗn hợp kháng nguyên hệ HLA. (thường hãng sản xuất cung cấp tài liệu dạng sơ đồ cho biết kháng nguyên trong có từng giếng).
- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
 
3. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu dùng là mẫu huyết thanh tách từ máu không chống đông.
- Mẫu cho xét nghiệm có thể bảo quản 7 ngày ở nhiệt độ 2-8oC. Muốn bảo quản lâu hơn, mẫu huyết thanh phải được giữ âm sâu  (≤ -20oC).
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị mẫu
- Lấy 2ml máu ngoại vi vào ống nghiệm không chống đông, ghi rõ thông tin người bệnh: tên, tuổi, số giường, khoa phòng, đúng với thông tin trên phiếu chỉ định.
- Tách huyết thanh: để mẫu đông tự nhiên. Dùng que thủy tinh tách lớp huyết thanh đông khỏi thành ống.
- Ly tâm ống máu đông 2000 vòng/phút trong 3 phút, sẽ thu được lớp huyết thanh màu vàng nổi lên phía trên.
- Pha loãng huyết thanh người bệnh bằng dung dịch pha loãng mẫu theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít.
2. Chuẩn bị hóa chất
- Đưa hóa chất ra nhiệt độ phòng, pha dung dịch rửa, huyết thanh chứng, cộng hợp, và cơ chất tạo mầu về nồng độ phản ứng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
3. Tiến hành xét nghiệm
- Đưa phiến phản ứng ra nhiệt độ phòng 15 phút.
- Nhỏ bệnh phẩm, dung dịch pha loãng kháng thể (giếng blank), và huyết thanh chứng vào các vị trí đã quy định trên phiến (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).
- Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

- Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 20 uL/giếng, mỗi lần để 2 phút.
- Nhỏ 10 uL cộng hợp vào mỗi giếng, ủ 40 phút.
- Rửa 2 lần bằng dung dịch rửa, 20 uL/giếng, mỗi lần để 2 phút.
- Nhỏ 10 uL Substrate vào mỗi giếng, ủ 15 phút.
- Nhỏ 10 uL dung dịch ngưng phản ứng vào mỗi giếng. Đọc kết quả trên máy đo ELISA dùng cho phiến Terasaki, dùng phần mềm của hãng sản xuất kít. Kết quả được xuất dưới dạng các giếng âm tính và dương tính.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Mẫu xét nghiệm được đọc kết quả như sau:
+ Các giếng chứng dương xuất hiện màu rõ (thường là màu xanh lam).
+ Các giếng chứng âm không bắt màu.
- Nếu không đạt các yêu cầu trên thì xét nghiệm phải tiến hành lại.
- Cách đọc kết quả: kết quả được đọc dưới dạng « âm tính » hoặc « %
dương tính ». Cách tính toán như sau:
 
% dương tính = (số giếng dương tính)/ Tổng số giếng phản ứng cho 1 người bệnh.
  hi ch : Giếng dương tính: là giếng có phản ứng cho màu xanh lam. Tổng số giếng phản ứng: là tổng số giếng dùng cho 1 người bệnh đã loại đi các giếng dùng làm chứng âm, chứng dương và chứng blank.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí:  yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
- Các mẫu chứng dương lại âm tính dương hoặc mẫu chứng âm lại dương tính. Thường do hóa chất hết hạn hoặc do chuẩn bị hóa chất sai.
Xử trí: kiểm tra hạn sử dụng của hóa chất, không dùng hóa chất hết hạn. Làm lại xét nghiệm và tuân thủ đúng các bước trong quy trình.
 

TÀI LIỆU THAM KHẢO
One Lambda, 2010. Lamda Antigen Tray Class I and Class II 88 antigen panel. User manual.

XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT FISH
(Fluorescence in situ hybridization)
GENE ANALYSIS BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
 
 I. NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử ADN tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử ADN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại ghép nhau theo nguyên tắc bổ sung.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các probe là đoạn ADN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách chính xác và nhanh chóng.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định ở giai đoạn chẩn đoán bệnh hoặc giai đoạn theo dõi điều trị bệnh cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính liên quan đến các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền - Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang;
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22,
pipetman 100 μl, 10 μl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
 
2.2. Hóa chất
- Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện;
- Dung dịch 10% formamide: 5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC;
- Dung dịch 2X SSC;
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40;
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40;
- Cồn 70o, 85o, 100o.
 
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
- 2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml. Máu hoặc tủy xương được nuôi cấy trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ, tiến hành thu hoạch huyền dịch tế bào.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Chuẩn bị tiêu bản
- Nếu sử dụng kỹ thuật FISH trên các cụm kỳ giữa (metaphase) thì cần nuôi cấy và chuẩn bị tiêu bản như kỹ thuật xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể. Trong trường hợp sử dụng trên nhân tế bào thì có thể bỏ qua bước nuôi cấy.
- Nhỏ huyền dịch tế bào lên tiêu bản.
Yêu cầu: hình thái nhân rõ ràng, tế bào dàn đều, các cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa to và bung đẹp.
- Dùng bút kim cương đánh dấu trên bề mặt tiêu bản những vùng đáp ứng được yêu cầu trên.
2.2. Rửa tiêu bản
- Ngâm tiêu bản vào dung dịch 2X SSC ở 37±1oC trong 15 phút;
- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5phút;
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa dung dịch formaldehyde 10% ở nhiệt độ phòng trong 5 phút;
- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5phút; 
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 70o trong 1 phút;
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 85o trong 1 phút;
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 100o trong 1 phút;
- Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.
 
2.3. Chuẩn bị probe
- Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 μl probe + 7 μl LSI + 2
μl dH2O) /1tiêu bản.
- Ly tâm nhẹ.
 
2.4. Lai
- Nhỏ 10 μl  dung dịch probe vào khu vực đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.
Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.
- Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.
- Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương trình biến tính ở 73oC trong 3
phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.
 
2.5. Rửa sau khi lai
- Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip;
- Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau.
+ Dung dịch (0,4X SSC/ 0.3% NP40): 2 phút, 73oC;
+ Dung dịch (2X SSC/ 0,1% NP40): 1phút, nhiệt độ phòng.
- Làm khô tiêu bản.
 
2.6. Chống mất màu probe
- Nhỏ 10-20 μl  dung dịch DAPI/antifade (1:20) lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và nhuộm nhân tế bào.
- Phủ kín tiêu bản bằng coverslip.
Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, chúng ta sẽ thấy 3 màu.
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào
+ Màu xanh lá cây: màu của probe
+ Màu đỏ: màu của probe
- Nguyên tắc phân tích kết quả được liệt kê trong bảng sau
 
Hƣớng dn đọc kết quả trong Dual colour FISH
 
1
 
Không đếm. Hai nhân tế bào xếp chồng lên nhau.

 
 
2
  Một tín hiệu đỏ và một tín hiệu xanh. Tín hiệu đỏ
bị khuyếch tán .
 
3
  Không đếm. Các nhân tế bào quá gần nhau, không xác định được ranh giới.
 
4
  Một tín hiệu đỏ và một tín hiệu xanh. Tín hiệu đỏ
bị phân hóa.
 
5
  Một tín hiệu đỏ và hai tín hiệu xanh. Một tín hiệu
xanh và một tín hiệu đỏ bị phân hóa.
 
6
   
Hai tín hiệu đỏ và một tín hiệu xanh.
 
7
   
Ba tín hiệu đỏ và một tín hiệu xanh.
 
8
   
Bốn tín hiệu đỏ.
 
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
 
Vn đề Nguyên nhân Cách khắc phục
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Không có tín hiệu hoặc tín hiệu yếu
Kính  hiển  vi  không  thích  hợp
hoặc có sự cố
 
Kiểm tra lại kính và các vật kính
 
Probe không biến tính hoàn toàn
Kiểm  tra  nhiệt  độ  bể  ấm  có  đúng
(73+/-1)oC
 
 
Điều kiện lai không thích hợp
Kiểm tra nhiệt độ tủ ấm có đúng 37oC
hay không.
Tăng thời gian lai lên 1giờ.
 
 
Điều kiện rửa không thích hợp
Kiểm tra nhiệt độ bể ấm có đúng 73oC
Kiểm tra các thành phần dung dịch rửa (pH…)
Xuất hiện bọt khí giữa tiêu bản
và coverslip
 
Loại bỏ bọt khí
Bảo  quản  probe  không   đúng
cách
Bảo quản probe ở -20oC, không ánh
sang
Tín    hiệu Điều kiện lai không thích hợp Kiểm tra nhiệt đổ tủ ấm có đúng 37oC

 
đặc  trưng
yếu
 
Nhiệt độ dung dịch rửa quá thấp
Duy  trì  nhiệt  độ  dung  dịch  rửa  ở
(73+/-1)oC
 
 
 
 
 
 
Nền    quá bẩn
Tiêu bản làm già quá mức cho
phép hoặc chứa nhiều tế bào chất
Tăng thời gian biến tính của tiêu bản
lên 10 phút
Tiêu bản không sạch hoặc nhiều
mảnh vỡ tế bào trên tiêu bản
 
Chuẩn bị lại tiêu bản
 
Các mảnh ADN không sạch
Thực hiện lại bước rửa tiêu bản sau
khi lai với formamide
Dung dịch rửa sai thành phần và
nhiệt độ
 
Kiểm tra lại dung dịch rửa
 
 
 
Hình thái các nhiễm sắc thể bị co cụm, biến dạng
 
Để tiêu bản bị quá khô
Tăng độ ẩm hoặc tăng nhiệt độ bể ấm
trong quá trình tiến hành thí nghiệm
 
 
Tiêu  bản  chưa  được  sấy  khô trước khi biến tính
Chuẩn bị lại xét nghiệm với tiêu bản
mới
Làm già tiêu bản trước khi tiến hành
FISH 24 giờ
 
Tiêu bản chưa khô sau  biến tính
Sấy tiêu bản ở nhiệt độ 45oC trong 10-
15 phút sau biến tính
   
Nhiệt độ bể ấm quá cao
Kiểm  tra  nhiệt  độ  bể  ấm  có  đúng
(73+/-1)oC
  Thời gian biến tính quá lâu Giảm thời gian biến tính 1 phút
Tín    hiệu
quá mạnh
Nồng độ probe sử dụng quá cao
so với dải màu của KHV
Cố gắng chỉnh kính thay thế bằng các
dải màu trung lập
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2.  Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.

NHUỘM BĂNG G NHIỄM SẮC THỂ
G-BAND STAINING
 
 I. NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật nhuộm băng G được sử dụng để nhuộm nhiễm sắc thể ở kỳ giữa. Nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể) ở kỳ giữa được xử lý bằng enzym phân giải protein và được nhuộm với Giemsa. Băng tối là đoạn ADN giàu A, T (ngược lại với băng R), băng sáng là những đoạn giàu G, C. Phương pháp được sử dụng để nhận dạng các nhiễm sắc thể  và phát hiện bất thường nhiễm sắc thể, dựa vào đặc điểm các băng sáng tối trên mỗi nhiễm sắc thể.
II. CHỈ ĐỊNH
Kỹ thuật này được sử dụng trong xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể máu ngoại vi/tủy xương được để nhận diện bất thường nhiễm sắc thể..
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- 02 cóng Coplin jar;
- 03 cốc thủy tinh 100ml;
- 01 cặp không mấu.
 
2.2. Hóa chất
- Enzym phân giải protein (trypsin);
- Đệm pH 6,8 (KH2PO4: 9,1g/l; Na2HPO4.2H2O: 11,5g/l);
- Chất ức chế enzym (huyết thanh bào thai bê - FBS);
- Nước muối 9‰.
 
3. Bệnh phẩm
Tiêu bản nhiễm sắc thể kì giữa đã được sấy khô (theo quy trình “ Xét nghiệm công thức Nhiễm sắc thể”).
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị
 
1.1. Chuẩn bị tiêu bản

Tiêu bản sau khi thu hoạch được cho vào tủ sấy 50-60◦C 24 giờ, hoặc để khô tự nhiên 3 ngày trở lên.
1.2. Chuẩn bị hóa chất
- Cốc 1: Pha 0.05g trypsin bột vào 50ml nước muối 0.9‰;
- Cốc 2: Pha 100ml FBS 2%;
- Cốc 3: Nước muối 9‰;
- Cốc 4: Nước muối 9‰;
- Cốc 5: Pha Giêmsa 10% trong đệm pH 6,8;
- Cốc 6: Đệm pH 6,8.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
- Nhúng tiêu bản trong cốc 1 từ 1-2 phút;
- Chuyển sang cốc 2/30 giây;
- Chuyển sang cốc 3/15giây;
- Chuyển sang cốc 4/15 giây;
- Chuyển sang cốc 5 /10 phút;
- Chuyển sang cốc 6 /15 giây;
- Rửa dưới vòi nước chảy
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Tiêu bản sau khi nhuộm băng G được phân tích bất thường về số lượng, cấu trúc trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1.000 lần và được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
 
Vn đề Nguyên nhân Xử trí
Băng  không  cắt  (Không
hình thành các băng nhạt)
Để  thời  gian  cắt  của
enzym không đủ.
Để thêm thời gian cắt của
enzym.
Băng bị cắt quá (nhiễm sắc
thể quá nhạt  màu,  không rõ các băng đậm màu)
Để  thời  gian  cắt  của
enzym dài quá, dung dịch pha enzym phân giải không đúng.
Điều chỉnh lại thời gian cắt
của enzym cho hợp lý.
Pha lại enzym nếu nhầm dung dịch đệm.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Margaret J. Barch, ( 1991 ), “The ACT Cytogenetics Laboratory Manual”,
Raven press.

2.  Phạm Quang Vinh, Đỗ Trung Phấn, (2009), “Các kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể”, “Kỹ thuật huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng”, Nhà xuất bản Y học, pp110-119.

CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ TỦY
KARYOTYPING ANALYSIS OF BONE MARROW SAMPLE
 
I. NGUYÊN LÝ
Tế bào tủy là những tế bào non có khả năng phân bào. Do đó người ta có thể sử dụng thu hoạch trực tiếp hoặc nuôi cấy trong môi trường nhân tạo mà không cần chất kích thích non hóa. Sau đó dùng chất ức chế phân bào ức chế tế bào ở kỳ giữa của quá trình phân bào lúc này nhiễm sắc thể có hình dạng điển hình nhất, thu hoạch rồi chuẩn bị tiêu bản phân tích cụm nhiễm sắc thể.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo làm kỹ thuật.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Ống falcon 50 ml vô trùng;
- Chai nuôi cấy vô trùng;
- Bộ dụng cụ đếm bạch cầu;
- Lam kính;
- Giá để lam;
- Ống falcon 15 ml;
- Ống nghiệm thủy tinh;
- Pipet Pasteur;
- Ống eppendorf;
- Ống chứa chất chống đông heparin sodium 5ml.
 
2.2. Hóa chất
- Môi trường nuôi cấy tế bào (RPMI 1640 có L-glutamin, Hepes);
- Huyết thanh bào thai bê (FBS);
- Dung dịch ức chế phân bào (Colcemide 0,01 ‰ (10µg/ml));
- Dung dịch nhược trương(KCL 0,075M (pH=7,4);
- Dung dịch đếm bạch cầu;
- Methanol tuyệt đối;
- Acid acetic;
- Kháng sinh (Streptomicin 10mg/ml + Penecilin 10,000UI/ml).
 
3. Bệnh phẩm
2ml tủy được chứa trong ống có chất chống đông heparin sodium.
 
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1.1. Nuôi cấy
1.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Cho 45ml môi trường nuôi cấy vào ống falcol 50ml, cho thêm 5ml huyết thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh, sau đó trộn đều.
1.2. Đếm số lượng tế bào
- Ly tâm 1.000 vòng/phút trong 8 phút lấy lớp buffy coat cho vào 3ml môi trường trộn đều và đếm số lượng tế bào tủy trong hỗn dịch.
- Tính toán số lượng tế bào cho vào mỗi chai nuôi cấy sao cho số lượng tế bào đạt từ 1- 4x106 tế bào/ml môi trường nuôi cấy.
1.3. Chuẩn bị chai nuôi cấy
- Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch.
- Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy.
1.4. Nuôi cấy tế bào
Nhỏ lượng tế bào như tính toán vào chai nuôi cấy đã chuẩn bị. Lắc nhẹ cho mẫu tan vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 /
24 giờ.
 
2. Thu hoạch
2.1. Nhỏ colcemide: Sau 24 giờ cho vào mỗi chai nuôi cấy 50 ml dung dịch
colcemide 0.010/00 (10μg/ml), đặt lại trong tủ ấm trong 15 phút.
2.2. Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:
- Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ 8ml/mẫu)
- Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: 3 methanol : 1 acid acetic
- Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo số lượng ống cấy.
2.3. Chuyển toàn bộ huyền dịch ở chai nuôi cấy vào ống falcon 15ml, ly tâm ở
máy ly tâm ngang 1.000 vòng/phút trong 8 phút.

2.4. Sau khi ly tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 5 mm).
2.5. Cho thêm 8ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37oC vào ống ly tâm, trộn
nhẹ một vài lần rồi ủ ở bể ấm 37oC trong 18 phút.
2.6. Sau khi ủ 18 phút cho thêm vào mỗi ống 0.5-1 ml dung dịch carnoy, trộn nhẹ để 5-10 phút.
2.7. Lấy ống ra ly tâm lấy cặn, hút bỏ dịch nổi phía trên. Cho thêm vào mỗi ống
10ml dung dịch carnoy trộn đều để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
2.8. Lặp lại bước 7 đến khi cặn tế bào trắng. Tái huyền dịch bằng carnoy.
 
3.Nhỏ tiêu bản
- Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn tuyệt đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô.
- Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để
nghiêng 20 - 300 trên giấy thấm.
- Nhỏ một giọt huyền dịch vừa pha lên lam kính. Chú ý khi nhỏ tiêu bản để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10-20 cm.
- Để tiêu bản khô tự nhiên trước khi nhuộm.
Lưu ý: Trong trường hợp còn huyền dịch thì lưu vào ống eppendorf để nhỏ thêm tiêu bản khi cần.
4. Nhuộm Giêmsa
- Pha Giêmsa 10% từ Giêmsa mẹ;
- Nhuộm tiêu bản 5-10phút;
- Rửa dưới vòi nước;
- Sấy khô trong tủ sấy 60◦C.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Tiêu bản sau khi nhuộm Giêmsa và băng G, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể sẽ được khảo sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1.000 lần và được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
2. Một số quy tắc trong khi phân tích:
- Thừa nhiễm sắc thể: có từ 2 cụm kỳ giữa trở lên thừa cùng 1 nhiễm sắc thể.
- Thiếu nhiễm sắc thể: có từ 3 cụm kỳ giữa trở lên thiếu cùng 1 nhiễm sắc thể.
- Bất thường cấu trúc: có từ 2 cụm trở lên mang cùng 1 bất thường.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
 
Vn đề Nguyên nhân Xử trí
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Không có    cụm kỳ   giữa (cụm mitose),
ít cụm.
Nồng độ chất chống đông không
đúng.
Kiểm tra lại nồng độ chất chống
đông.
Lấy sai chất chống đông, cho mẫu
vào  dung  dịch  chống  đông: lithium heparin, EDTA, phenol- heparin, natricitrat…
Yêu cầu lấy lại mẫu nếu có thể.
Nếu không thể lấy lại mẫu có thể rửa lại tế bào bằng môi trường nuôi cấy trước khi nuôi cấy.
Chuyển mẫu và bảo quản mẫu Kiểm  tra  một  số  vấn  đề:  thời
gian từ khi lấy mẫu tới khi nhận mẫu, nhiệt độ, áp suất, pH môi trường dùng lưu mẫu khi vận chuyển mẫu.
Nhiệt độ , CO2 trong tủ nuôi cấy
không  đúng,  quá  cao  hoặc  quá thấp.
Kiểm tra lại nhiệt độ, CO2 trong
tủ ấm, nếu không đảm bảo phải mời kỹ sư điều chỉnh lại.
Môi trường nuôi cấy không đầy đủ
(L-glutamin không còn hoạt tính, giảm hoạt tính)
Thêm L-glutamin mới.
Huyết   thanh   không   phù   hợp
(huyết  thanh  không  hỗ  trợ  được cho sự phát triển của tế bào (huyết thanh mất hoạt tính) hoặc gây độc cho tế bào)
Sử  dụng  lô  huyết  thanh  khác,
hoặc ống huyết thanh mới (các ống huyết thanh được tách ra từ chai to), loại huyết thanh khác (huyết thanh bào thai bê, huyết thanh  bò,  huyết  thanh  AB người).
Sử dụng đồ thủy tinh (pipet thủy
tinh,  pipet  Pasteur),  đồ  nhựa  bị lỗi(chai nuôi cấy, đĩa petri)...
Thử thay đổi sang loại pipet mới,
chai nuôi cấy, đĩa petri mới.
Màng  tế
bào
không vỡ ra được
Thời gian nhược trương không đủ,
sai về nồng độ nhược trương.
Rửa  lại  cặn  tế  bào  bằng  dung
dịch carnoy tỷ lệ 2:1.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Margaret J. Barch, ( 1991 ), “The ACT Cytogenetics Laboratory Manual”,
Raven press.
2.  Phạm Quang Vinh, Đỗ Trung Phấn, (2009), “Cấy máu ngoại vi phân tích nhiễm sắc thể”, “Kỹ thuật huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng”, Nhà xuất bản Y học, pp103-110.

CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ MÁU NGOẠI VI
KARYOTYPING ANALYSIS OF PERIPHERAL BLOOD SAMPLE
 
 I. NGUYÊN LÝ
Các tế bào lympho máu ngoại vi khi tiếp xúc với chất gây phân bào có khả năng chuyển dạng thành tế bào non và phân chia. Lợi dụng khả năng đó, người ta nuôi cấy máu ngoại vi trong môi trường có chất kích thích phân bào và sau đó làm ngừng phân bào ở kỳ giữa, giai đoạn có hình dạng nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể) điển hình, để làm tiêu bản quan sát  nhiễm sắc thể. Phân tích nhiễm sắc thể tế bào máu ngoại vi cho phép chẩn đoán các hội chứng di truyền do bất thường nhiễm sắc thể, xác định nhiễm sắc thể giới của cá thể.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính hoặc nghi ngờ mắc bệnh lý di truyền bẩm sinh.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo làm kỹ thuật.
 
2. Phƣơng tiện - hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Ống falcon 50 ml vô trùng;
- Chai nuôi cấy vô trùng;
- Lam kính;
- Giá để lam;
- Ống falcon 15 ml;
- Ống nghiệm thủy tinh;
- Pipet Pasteur;
- Ống eppendorf;
- Ống chứa chất chống đông heparin sodium 5ml.
 
2.2. Hóa chất
- Môi trường nuôi cấy tế bào (RPMI 1640 có L-glutamin, Hepes);
- Huyết thanh bào thai bê (FBS);
- PHA (phitohemagglutinin);

- Kháng sinh: streptomycin 10mg/ml + penicilin 10.000UI/ml;
- Dung dịch colcemide 0,01‰ (10µg/ml);
- Dung dịch nhược trương: KCL 0,075M (pH=7,4);
- Dung dịch đếm bạch cầu;
- Methanol tuyệt đối;
- Acid acetic.
 
3. Bệnh phẩm
2ml  máu  ngoại vi được chứa trong ống có  chất  chống đông heparin
sodium.
 
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Nuôi cấy
1.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Cho 45ml môi trường nuôi cấy vào ống falcon 50ml, cho thêm 5ml huyết thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh trộn kỹ.
1.2. Chuẩn bị chai nuôi cấy
- Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch;
- Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy.
1.3. Nuôi cấy tế bào
Cho 1ml máu ngoại vi, 200µl PHA vào chai nuôi cấy. Lắc nhẹ cho mẫu được trộn đều vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37oC, 5%CO2 trong 72 giờ.
2. Thu hoạch
2.1. Nhỏ colcemide: Sau 72 giờ, cho vào mỗi chai nuôi cấy 50 ml dung dịch
colcemide 0,010/00 (10mg/ml), đặt lại chai nuôi cấy vào tủ ấm trong 50 phút.
2.2. Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:
- Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm chai dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ 8ml cho một chai nuôi cấy).
- Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: 3 methanol: 1 acid acetic.
- Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo số lượng ống cấy.
2.3. Sau đó chuyển toàn bộ huyền dịch ở chai nuôi cấy vào ống falcon 15ml, ly tâm ở máy ly tâm ngang 1.000 vòng/phút trong 8 phút.
2.4. Sau khi ly tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 5 mm).

2.5. Cho thêm vào ống ly tâm 8ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37oC
trước,trộn nhẹ một vài lần rồi ủ ở bể ấm 37oC trong 30 phút.
2.6. Sau khi ủ 30 phút cho thêm vào mỗi ống 0.5-1 ml dung dịch carnoy, trộn nhẹ để 5-10 phút.
2.7. Lấy ống ra ly tâm lấy cặn, hút bỏ dung dịch nổi phía trên cho thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch carnoy trộn đều để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
2.8. Lặp lại bước 7 đến khi cặn trắng. Tái huyền dịch bằng dung dịch carnoy.
 
3. Nhỏ tiêu bản
- Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn tuyệt đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô;
- Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để
nghiêng 20 - 30o trên giấy thấm;
- Nhỏ một giọt huyền dịch  lên lam kính. Chú ý khi nhỏ tiêu bản để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10-20 cm;
- Để tiêu bản khô tự nhiên.
Lưu ý: Trong trường hợp còn huyền dịch thì lưu vào ống eppendorf để nhỏ lại lam khi cần.
4. Nhuộm Giêmsa
- Pha Giêmsa 10% từ Giêmsa mẹ nhuộm lam 5-10 phút;
- Rửa dưới vòi nước;
- Sấy khô trong tủ sấy 60oC.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Tiêu bản sau khi nhuộm Giêmsa và nhuộm băng G, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể sẽ được khảo sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại
1.000 lần và được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
2. Một số quy tắc trong khi phân tích:
- Thừa nhiễm sắc thể: có từ 2 cụm phân bào trở lên thừa cùng 1 nhiễm sắc thể.
 
 - Thiếu nhiễm sắc thể: có từ 3 cụm phân bào trở lên thiếu cùng 1 nhiễm sắc thể.
 
 - Bất thường cấu trúc: có từ 2 cụm trở lên mang cùng 1 bất thường.

 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
 
Vn đề Nguyên nhân Xử trí
  Nồng độ chất chống đông không Kiểm tra lại nồng độ chất chống đông.

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Không có cụm  kỳ giữa (cụm mitose), ít cụm.
đúng.  
Lấy  sai  chất  chống  đông,  cho
mẫu vào dung dịch chống đông: lithium heparin, EDTA, phenol- heparin, natricitrat…
Yêu cầu lấy lại mẫu nếu có thể.
Nếu không thể lấy lại mẫu có thể rửa lại tế bào bằng môi trường nuôi cấy trước khi nuôi cấy.
Chuyển mẫu và bảo quản mẫu Kiểm tra một số vấn đề: thời gian từ
khi lấy mẫu tới khi nhận mẫu, nhiệt độ, áp suất, pH môi trường dùng lưu mẫu khi vận chuyển mẫu.
Nhiệt độ , CO2 trong tủ nuôi cấy
không  đúng,  quá  cao  hoặc  quá thấp.
Kiểm tra lại nhiệt độ, CO2 trong tủ
ấm, nếu không đảm bảo phải mời kỹ sư điều chỉnh lại.
Môi trường nuôi cấy không đầy
đủ (L-glutamin không còn hoạt tính, giảm hoạt tính)
Thêm L-glutamin mới.
Huyết   thanh   không   phù   hợp
(huyết thanh không hỗ trợ được cho  sự  phát  triển  của  tế  bào (huyết thanh mất hoạt tính) hoặc gây độc cho tế bào)
Sử  dụng  lô  huyết  thanh  khác,  hoặc
ống huyết thanh mới (các ống huyết thanh được tách ra từ chai to), loại huyết  thanh  khác  (huyết  thanh  bào thai bê, huyết thanh bò, huyết thanh AB người).
Sử dụng đồ thủy tinh (pipet thủy
tinh, pipet Pasteur), đồ nhựa bị lỗi(chai nuôi cấy, đĩa petri)...
Thử thay đổi sang loại pipet mới, chai
nuôi cấy, đĩa petri mới.
Màng      tế
bào   không
vỡ ra được
Thời  gian  nhược  trương  không
đủ, sai về nồng độ nhược trương.
Rửa  lại  cặn  tế  bào  bằng  dung  dịch
carnoy tỷ lệ 2:1.
 
 
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Margaret J. Barch, ( 1991 ), “The ACT Cytogenetics Laboratory Manual”,
Raven press.
2.  Phạm Quang Vinh, Đỗ Trung Phấn, (2009), “Kỹ thuật huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng”,pp103-110, Nhà xuất bản Y học.

CẤY HỖN HỢP TẾ BÀO LYMPHO
MIXED LYMPHOCYTE CULTURE
 
 I. NGUYÊN LÝ
Khi nuôi cấy tế bào lympho nếu trong môi trường có kháng nguyên lạ, tế bào lympho sẽ non hóa và nhân lên. Cấy hỗn hợp là đưa tế bào lympho của người cho đã bất hoạt bằng mitomicin C hoặc chiếu xạ cho tiếp xúc với tế bào lympho của người nhận. Nếu tế bào lympho của người nhận mẫn cảm hoặc phản ứng với kháng nguyên trên tế bào lympho của người cho càng mạnh thì số lượng tế bào lympho của người nhận non hóa và nhân lên càng nhiều. Tế bào nhân lên sử dụng các bazơ nitơ tự do để tổng hợp ADN. Do đó, có thể ước lượng được
mức độ phản ứng bằng cách cho thêm [3H] thimidine (là một loại bazơ nitơ có
gắn đồng vị phóng xạ) vào môi trường nuôi cấy để phân tích lượng chất đồng vị phóng xạ dùng để đánh dấu này được sử dụng khi tế bào lympho của người nhận nhân lên.
Cấy hỗn hợp lympho chủ yếu sử dụng trong việc đánh giá mức độ hòa hợp kháng nguyên của người cho và người nhận trước khi ghép tạng. Ngoài ra, nó có thể được sử dụng để nghiên cứu các đáp ứng miễn dịch ở mức độ tế bào.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định trong trường hợp cần đánh giá mức độ hòa hợp kháng nguyên của người cho và người nhận trước khi ghép tạng.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm đã được đào tạo kỹ thuật XN miễn dịch – di
truyền.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: tủ ấm CO2, máy ly tâm lạnh, máy đếm phóng xạ nhấp nháy lỏng, kính hiển vi đảo ngược, pipet man.
- Dụng cụ: Ống nghiệm vô trùng, đĩa nuôi cấy 96 giếng 0,2 ml, bơm kim tiêm, đầu côn lọc.
2.2. Hóa chất

- Môi trường RF10-M: 100 ml bao gồm:
+ 86 ml môi trường RPMI.
+ 10 ml huyết thanh bào thai bê.
+ 0.1 ml 2 – mercaptoethanol nồng độ 5x10-2 M.
+ 1 ml kháng sinh streptomycin 10mg/ml + penicilin 10,000UI/ml.
+ 1 ml L-glutamin 200 mM.
+ 2 ml Hepes buffer 1 M.
- [3H] thymidine.
- Lymphoprep.
 
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
04 ml máu toàn phần của người bệnh cần ghép và người cho chống đông bằng heparin 5.000 đơn vị/ml.
2. Tiến hành kỹ thuật
- Tách tế bào lympho:
+ Chuẩn bị 2 ống nghiệm vô trùng có 2ml lymphoprep.
+ Cho 4 ml máu ngoại vi của người cho và người nhận vào 2 ống nghiệm trên.
+ Ly tâm tốc độ 2500 vòng/phút trong 15 phút để tách tế bào lympho.
+ Hút cẩn thận toàn bộ lớp tế bào đơn nhân ở giữa và cho vào 2 ống nghiệm vô trùng.
- Tái huyền dịch tế bào lympho vào môi trường RF10-M.
- Cho thêm 100 µl mitomycin C nồng độ 50 µg/ml vào ống nghiệm chứa tế bào lympho của người cho trong 20 phút để bất hoạt tế bào lympho.
- Cho thêm 2 ml RF10-M vào ống nghiệm đã được xử lý với mitomicin C. Ly tâm tốc độ1.000 vòng/ 10 phút và bỏ dịch nổi. Lặp lại bước rửa này 03 lần.
- Cho 100 µl huyền dịch tế bào lympho của người nhận có nồng độ tế bào
2 x 105 /ml vào giếng của phiến nuôi cấy 96 giếng (cho vào 3 giếng).
- Cho tiếp 100 µl huyền dịch tế bào lympho đã bất hoạt của người cho có nồng độ tế bào 5 x 106 (cả 3 giếng nêu trên).
- Cho 200 µl huyền dịch tế bào lympho của người nhận có nồng độ tế bào
2 x 105 /ml vào giếng thứ 4 của phiến nuôi cấy 96 giếng làm chứng âm.
- Đặt phiến nuôi cấy vào tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 78 giờ.

- Cho 1 µCi [3H] Thymidine vào mỗi giếng (cả 4 giếng nêu trên), đặt phiến nuôi cấy vào tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 18 giờ.
- Thu hoạch tế bào và đọc kết quả trên máy đếm nhấp nháy lỏng theo cơ chế đơn vị đếm được tính theo đơn vị phóng xạ (cpm).
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sử dụng phần mềm phân tích kết quả đối chiếu giữa các giếng chứng và giếng thực nghiệm.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Không đảm bảo vô trùng:  Cần thao tác và chuẩn bị dụng cụ, môi trường vô khuẩn,  khử khuẩn khu vực thực hiện ít nhất 15 phút trước khi thực hiện kỹ thuật.
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Greg  A.   Perry,  (1976),   “   Mixed   Lymphocyte  culture”,   Creigton
university.
2. John  E.  Coligan,  Ada  M.  Kruisbeek,  David  H  Margulies,  Ethan  M.
Shevach, Warren Strober, (1991), Current protocols in immunology, John
Wiley & Son Press.

PHÁT HIỆN NGƢỜI MANG GEN HEMOPHILIA (bằng kỹ thuật PCR-RFLP)
DETECTION OF HEMOPHILIA CARRIER BY PCR-RFLP
 
 I. NGUYÊN LÝ
Tính đa hình (polymorphism) của một số đoạn gen là hiện tượng khác nhau một hoặc một nhóm nucleotid ở một vị trí nhất định trên gen nhưng không làm thay đổi hoạt động của gen. Các đa hình này thường nằm trong trình tự nhận biết của một hoặc một số enzym giới hạn và có thể được phát hiện khi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP. Xác định đa hình đặc trưng ở người bệnh hemophilia, sau đó sử dụng đa hình này để tìm kiếm cá thể mang gen trong gia đình dựa trên nguyên tắc các gen nằm gần nhau thì di truyền cùng nhau. Đầu tiên, sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm có chứa gen đa hình, sau đó cắt sản phẩm PCR này với một enzym giới hạn đặc hiệu với vị trí đa hình. Quan sát các sản phẩm cắt, sẽ nhận dạng được gen.
Yêu cầu để thực hiện kỹ thuật:
+ Phải biết người mẹ là người chắc chắn mang gen hemophilia (carrier) và cần phải xét nghiệm đặc tính đa hình của gen ở người mẹ, người mẹ phải là người dị hợp tử với đặc tính đa hình.
+ Phải xét nghiệm đặc tính đa hình của bố và của người bệnh hemophilia (là anh trai hoặc em trai của người cần phát hiện hoặc người bệnh là một người nam giới liên quan khác như bác ruột về phía mẹ).
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả những người phụ nữ trong gia đình có tiền sử mắc bệnh Hemophilia mà có nhu cầu xác định tình trạng mang gen.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất

2.1. Phương tiện
- Máy PCR;
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp  ảnh;
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-8oC, tủ âm sâu -200C;
- Găng tay.

2.2 Hóa chất
- Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Hóa chất chạy PCR gồm:  Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu.
- Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông
EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông
EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ADN
Xem bài “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.

Bƣớc 2: PCR
- Thực hiện phản ứng PCR với sự tham gia của các thành phần sau:
PCR buffer 10X                                   5 µl ADN                                                100 ng Forward primer (10pM)                       1 µl Reverse primer (10pM)                        1 µl Taq-polymerase                                  0.5 U
H20                                          đủ thể tích 50 µl
Bƣớc 3: Cắt với enzym giới hạn
Thực hiện phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với các thành phần sau:
Đệm phù hợp với enzym giới hạn                       3 µl Sản phẩm PCR                                                           20-25 µl Enzym giới hạn                                                                      2 µl H20   đủ thể tích 30 µl
Bƣớc 4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt
Sử dụng 20-25 µl sản phẩm cắt cùng với 10 µl sản phẩm PCR và thang ADN chuẩn (marker)  điện di trên gel agarose. Tùy thuộc kích thước đoạn gen cần quan sát mà chọn nồng độ gel agarose và thời gian chạy điện di thích hợp. Sau đó kết quả được đọc và phân tích thông qua hình ảnh soi trên đèn UV.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Sản phẩm PCR phải có băng đặc hiệu, đúng kích thước theo tính toán lý thuyết.
- Nếu sản phẩm cắt có 2 băng ADN trở lên tức là có vị trí nhận biết của enzym giới hạn (không có đa hình)
- Nếu sản phẩm cắt vẫn còn nguyên sản phẩm PCR tức là mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn (có đa hình).
Phương  pháp  phát  hiện  các  đa  hình  gen  đặc  trưng  ở  người  bệnh hemophilia sau đó sử dụng các đa hình này để tìm kiếm cá thể mang gen trong gia đình là phương pháp  đã được thực hiện từ lâu trên thế giới. Ưu điểm của phương pháp là kỹ thuật thực hiện đơn giản, không cần phải đầu tư nhiều trang thiết bị đắt tiền và chi phí để thực hiện xét nghiệm thấp.
Tuy nhiên phương pháp này yêu cầu phải lấy mẫu của nhiều thành viên trong gia đình đồng thời phải biết được các đa hình có tần suất cao ở Việt nam.

Cách xác định tình trạng mang gen của một người nữ trong gia đình có người bệnh hemophilia:
- Lấy mẫu: bố mẹ của người nữ cần xác định, người bệnh là anh trai hoặc em trai hoặc một người nam giới liên quan khác như bác ruột về phía mẹ.
- Cách phân tích:
+ Phân tích người bệnh để xác định được allen liên quan đến gen yếu tố
VIII đột biến.
+ Phân tích bố, mẹ để xác định di truyền của các allen (allen bình thường và allen liên quan đến gen đột biến) cho các con. Trong đó người mẹ bắt buộc phải là thể dị hợp tử với đa hình phân tích. Phân tích mẫu của bố sẽ xác định được allen truyền cho con gái.
Kết hợp các kết quả phân tích trên sẽ xác định được người phụ nữ mang gen trong gia đình.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                 XỬ TRÍ

Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.

Thực  hiện  theo  đúng  hướng  dẫn  qui cách lấy mẫu.

Thao tác pipet không chính xác.            Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.          Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
Thực hiện đúng, đủ các bước      trong quy trình xét nghiệm.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.   D J Bowen. Haemophilia A and Haemophilia B: molecular insights. J Clin Pathol: Mol Pathol 2002; 55:1-8
2.  Keeney S et al. The molecular analysis of haemophilia A: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization Haemophilia Genetics Laboratory Network. Haemophilia 2005; 11: 387-97