Huyết Học-Truyền Máu-Miễn Dịch-Sinh Học Phân Tử Phần 4

Thứ năm - 10/09/2015 02:18
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định nhiễm sắc thể X, Y sử dụng các probe là các đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu cho các đoạn ADN trên nhiễm sắc thể X, Y để lai ghép với các đoạn ADN tương đồng ...
XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization)
C ĐỊNH NHIỄM SẮC THỂ X, Y
DETECTION OF X,Y CHROMOSOMES BY FLUORESCENCE IN SITU
HYBRIDIZATION
 
I. NGUYÊN LÝ
Nguyên lý chung: xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định nhiễm sắc thể X, Y sử dụng các probe là các đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu cho các đoạn ADN trên nhiễm sắc thể X, Y để lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể X hoặc Y. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện các nhiễm sắc thể này một cách chính xác.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định khi cần xác định giới tính hoặc xác định mọc mảnh ghép sau khi ghép khác giới tính.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền – Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang;
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22,
pipetman 100 µl, 10 µl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
 
2.2. Hóa chất
- X/Y ADN Probe Kit  Probe , DAPI/antifade;
- Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC
- Dung dịch 2X SSC;
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40;
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40;
- Cồn 70o, 85o, 100o.
 
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
Xem bài “Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, chúng ta sẽ thấy 3 màu:
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào;
+ Màu xanh lá cây: màu của probe gắn trên nhiễm sắc thể X;
+ Màu đỏ: màu của probe gắn trên nhiễm sắc thể Y.
 
Nhận định kết quả
+ Một tín hiệu đỏ, một tín hiệu xanh: XY;
+ Hai tín hiệu đỏ: XX.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2.  Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.

XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization)
C ĐỊNH NHIỄM SẮC THỂ Ph1(BCR/ABL)
DETECTION OF PH1(BCR/ABL) CHROMOSOME BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
 I. NGUYÊN LÝ
Nguyên lý chung: xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật
FISH”.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định nhiễm sắc thể Ph1 (BCR/ABL) sử dụng các probe là đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu với đoạn ADN của gen BCR trên nhiễm sắc thể số
22 và gen ABL trên nhiễm sắc thể số 9. Các probe này lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bệnh lý một cách chính xác và nhanh chóng.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho người bệnh trong trường hợp nghi ngờ có nhiễm sắc thể Ph.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền-Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang;
- Dụng cụ: cặp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 µl, 10 µl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
2.2. Hóa chất
- Probe BCR/ABL dual colour, dual fusion translocation probe, DAPI /
antifade;
- Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20XSSC
- Dung dịch 2X SSC
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40
- Cồn 70o, 85o, 100o
 
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
Xem bài “Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật dual colour FISH, chúng ta có thể thấy 3 màu.
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào
+ Màu xanh: màu của probe BCR (trên nhiễm sắc thể số 22)
+ Màu đỏ: màu của probe ABL (trên nhiễm sắc thể số 9)
+Màu da cam (đỏ/xanh): màu của fusion BCR/ABL
 
Nhận định kết quả:
+ Không có nhiễm sắc thể Ph1: hai tín hiệu đỏ và hai tín hiệu xanh.
+ Có nhiễm sắc thể Ph1 (có chuyển đoạn BCR/ABL): Một tín hiệu đỏ, một tín hiệu xanh, hai tín hiệu màu da cam.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2.  Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.

XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization) CHẨN ĐOÁN CHUYỂN ĐOẠN NHIỄM SẮC THỂ 4;11
DETECTION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION (4;11) BY
FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
 
 I. NGUYÊN LÝ
Nguyên lý chung: xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật
FISH”.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định t(4;11) sử dụng các probe là đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu với đoạn ADN của gen AF4 trên nhiễm sắc thể số 4 và gen MLL  trên nhiễm sắc thể số 11. Các probe này lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bệnh lý một cách chính xác và nhanh chóng.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho người bệnh trong trường hợp nghi ngờ có chuyển đoạn t(4;11).
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV . CHUÂN BỊ
1. Ngƣời thực hiện:
Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền-Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 µl, 10 µl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
2.2. Hóa chất
-  AF4/MLL  Dual  Color,  Dual  fusion  translocation  probe,  DAPI  /
antifade;
- Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20XSSC;
- Dung dịch 2X SSC;
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40;
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40;
- Cồn 70o, 85o, 100o.
 
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật FISH hai màu, chúng ta sẽ thấy 3 màu.
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào;
+ Màu xanh: màu của probe;
+ Màu đỏ: màu của probe.
 
Nhận định kết quả:
+ Không có chuyển đoạn t(4;11): hai tín hiệu đỏ và hai tín hiệu xanh;
+ Có chuyển đoạn t(4;11): một tín hiệu đỏ, một tín hiệu xanh, hai tín hiệu
màu da cam.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2.  Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.

XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization) CHẨN ĐOÁN CHUYỂN ĐOẠN NHIỄM SẮC THỂ 1;19
DETECTION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION (1;19) BY
FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
 
 I. NGUYÊN LÝ
Nguyên lý chung: xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật
FISH”.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định t(1;19) sử dụng các probe là đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu với đoạn ADN của gen  PBX1 trên nhiễm sắc thể số 1 và gen TCF3 trên nhiễm sắc thể số 19. Các probe này lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bệnh lý một cách chính xác và nhanh chóng.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho người bệnh trong trường hợp nghi ngờ có chuyển đoạn t(1;19).
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền-Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 µl, 10 µl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
2.2. Hóa chất
- LSI TCF3/PBX1 Dual Color, Dual fusion translocation probe, DAPI/
antifade;
- Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC
- Dung dịch 2X SSC;
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40;
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40;
- Cồn 70o, 85o, 100o
 
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật FISH hai màu, chúng ta sẽ thấy 3 màu.
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào;
+ Màu xanh: màu của probe;
+ Màu đỏ: màu của probe.
 
Nhận định kết quả
+ Không có chuyển đoạn t(1;19): hai tín hiệu đỏ và hai tín hiệu xanh;
+ Có chuyển đoạn t(1;19): một tín hiệu đỏ, một tín hiệu xanh, hai tín hiệu
màu da cam.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2.  Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.

XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization) XÁC ĐỊNH CHUYỂN ĐOẠN NHIỄM SẮC THỂ 8 VÀ 21
DETECTION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION (8;21) BY
FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
 I. NGUYÊN LÝ
Nguyên lý chung: xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật
FISH”.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định t(8;21) sử dụng các probe là đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu với đoạn ADN của gen AML1 trên nhiễm sắc thể số 8 và gen ETO trên nhiễm sắc thể số 21. Các probe này lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bệnh lý một cách chính xác và nhanh chóng.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho người bệnh trong trường hợp nghi ngờ có chuyển đoạn t(8;21).
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền-sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Dụng cụ - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 μl , 10 μl , xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
2.2. Hóa chất
- LSI AML1/ETO Dual color, Dual fusion translocation probe, DAPI /
antifade.
- Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20XSSC
- Dung dịch 2X SSC
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40
- Cồn 70o, 85o, 100o
 
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật FISH hai màu, chúng ta sẽ thấy 3 màu.
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào;
+ Màu xanh: màu của probe;
+ Màu đỏ: màu của probe;
 
Nhận định kết quả
+  Có  chuyển  đoạn  của  nhiễm  sắc  thể  8  và  21  (có  tổ  hợp  gen  lai
AML1/ETO): Một tín hiệu đỏ, một tín hiệu xanh, 2 tín hiệu màu da cam.
+ Bình thường (không có tổ hợp gen lai AML1/ETO): Hai tín hiệu đỏ và hai tín hiệu xanh.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2.  Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.

XÉT NGHIỆM FISH (Fluorescence in situ hybridization) XÁC ĐỊNH CHUYỂN ĐOẠN NHIỄM SẮC THỂ 15 VÀ 17
DETECTION OF CHROMOSOME TRANSLOCATION (15;17) BY
FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
 
 
I. NGUYÊN LÝ
Nguyên lý chung: xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật
FISH”.
Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH xác định t(15:17) sử dụng các probe là đoạn ADN có gắn huỳnh quang và có trình tự nucleotide bổ sung đặc hiệu với đoạn ADN của gen PML trên nhiễm sắc thể số 15 và gen RARA  trên nhiễm sắc thể số 17. Các probe này lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bệnh lý một cách chính xác và nhanh chóng.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho người bệnh trong trường hợp nghi ngờ có chuyển đoạn t(4;11).
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền-Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.
- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 μl , 10 μl , xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.
2.2. Hóa chất
- LSI PML/RARA Dual Color, Dual fusion translocation probe, DAPI /
antifade.
- Dung dịch 10% formamide:5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X SSC
- Dung dịch 2X SSC
- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40
- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40
- Cồn 70o, 85o, 100o
 
3. Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, với kỹ thuật FISH hai màu,
chúng ta sẽ thấy 3 màu.
+ Màu xanh da trời đậm: màu nhân tế bào
+ Màu xanh: màu của probe
+ Màu đỏ: màu của probe
 
Nhận định kết quả:
+  Có  chuyển  đoạn  của  nhiễm  sắc  thể  15  và  17  (có  tổ  hợp  gen  lai
PML/RARA): Một tín hiệu đỏ, một tín hiệu xanh, 2 tín hiệu màu da cam.
+ Bình thường (không có tổ hợp gen lai PML/RARA): Hai tín hiệu đỏ và hai tín hiệu xanh.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Xem bài “ Quy trình xét nghiệm gen bằng kỹ thuật FISH”.
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.
2.  Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.

TÁCH CHIẾT ADN TỪ MÁU NGOẠI VI/MÁU CUỐNG RỐN
DNA ISOLATION FROM PERIPHERAL BLOOD CELLS
 
 I. NGUYÊN LÝ
Các tế bào có nhân đều chứa ADN - vật chất di truyền của toàn bộ cơ thể. ADN nằm trên nhiễm sắc thể bên trong nhân tế bào. Để tách được ADN người ta thường sử dụng các chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân, kết hợp với sử dụng các chất biến tính mạnh để loại bỏ các protein sau đó sử dụng cồn 96o kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp để thu được ADN một cách tinh sạch và nguyên vẹn.
II. CHỈ ĐỊNH
Sử dụng cho tất cả người bệnh có chỉ định làm xét nghiệm PCR.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C;
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi/máu cuống rốn chống đông bằng EDTA.

V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi/máu cuống rốn chống đông bằng EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Phương pháp tách chiết ADN cơ bản bao gồm các giai đoạn chính sau:
 
Phá màng tế bào và màng nhân:
Bệnh phẩm được ủ trong một dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như SDS, sarcosyl) và enzym phân hủy protein (proteinaza K). Mục tiêu của bước ủ này là để phá màng tế bào và màng nhân đồng thời để ức chế hoạt động của các enzym ADNaza nội bào và tách protein ra khỏi các phân tử ADN.
Loi bỏ các protein:
Sử  dụng  dung  dịch  phenol/chloroform  để  biến  tính  protein,  làm  cho protein tạo thành một lớp tủa rõ rệt sau khi ly tâm, dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn dịch.
Kết tủa ADN:
Sử dụng cồn để tủa ADN trong điều kiện lạnh và thu nhận lại ADN bằng ly tâm. ADN cần phải hòa lại trong nước khử enzym nucleaza.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sử dụng 5µl ADN thu được để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,5 -
0,8%, đồng thời đo độ sạch bằng quang phổ (A260/A280). Chất lượng ADN tốt nếu chỉ xuất hiện một băng có kích thức lớn >10 kb và tinh sạch nếu A260/A280 trong khoảng 1,8 - 2,0.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
                                                 

§ Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.

§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.

§ Thao tác pipet không chính xác.     § Sử  dụng  pipet  theo  đúng  thể  tích  quy định.
§ Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.  § Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
§ Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit
nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124-125.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research.  Springer Verlag, Berlin.

TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÁU NGOẠI VI/TỦY XƢƠNG
RNA ISOLATION FROM PERIPHERAL BLOOD AND BONE MARROW SAMPLES
 
 
I. NGUYÊN LÝ
ARN  thông tin quy định các thông tin về axit amin và nằm trong tế bào chất của tế bào. Để tách được ARN người ta thường sử dụng các chất tẩy mạnh để phá màng tế bào, kết hợp với sử dụng các chất biến tính mạnh để loại bỏ các protein sau đó sử dụng cồn 960 kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp để thu được ARN một cách tinh sạch và nguyên vẹn.
II. CHỈ ĐỊNH
Sử dụng cho tất cả người bệnh có chỉ định làm xét nghiệm RT-PCR/qRT-
 
PCR.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo;
- Tất cả các mẫu bệnh phẩm có chỉ định xét nghiệm RT-PCR hoặc qRT-PCR.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C;
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất

Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Phương pháp tách chiết ARN cơ bản bao gồm các giai đoạn chính sau:
 
2.1.Loại bỏ các tế bào hồng cầu
ARN nằm ở tế bào chất bên trong các tế bào có nhân. Vì vậy thông thường bệnh phẩm sẽ được xử lý trước để loại bỏ bớt các tế bào hồng cầu. Để loại bỏ các tế bào hồng cầu có thể sử dụng dung dịch Ficoll (có tỷ trọng 1.077) để phân lớp các tế bào theo tỷ trọng hoặc sử dụng một số dung dịch ly giải hồng cầu (như dung dich gồm 1M MgCl2,  5M NaCl, 1M Tris-HCl). Sau khi loại bỏ bớt các tế bào hồng cầu, dung dịch còn lại chứa chủ yếu các tế bào có nhân sẽ được sử dụng để tách ARN.
2.2. Phá màng tế bào và màng nhân:
Các tế bào có nhân được ủ trong một dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như SDS, sarcosyl), một chất gây biến tính protein mạnh như (guanidinium thyocianat), một chất khử (2-mercaptoethanol). Mục tiêu của bước ủ này là để phá màng tế bào đồng thời để ức chế hoạt động của các enzym phân hủy ARN nội bào (ARNaza) và tách các protein lên kết khỏi phân tử ARN.
2.3.Loại bỏ các protein:
Sử  dụng  dung  dịch  phenol/chloroform  để  biến  tính  protein,  làm  cho protein tạo thành một lớp tủa rõ rệt sau khi ly tâm, dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn dịch
2.4.Kết tủa ARN:
Sử dụng cồn tuyệt đối để tủa ARN trong điều kiện đông lạnh và thu nhận lại ARN bằng ly tâm. ARN cần phải hòa lại trong nước khử enzym nucleaza.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sử dụng 5 µl ARN thu được để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,5 -
0,8%, đồng thời kiểm tra độ sạch bằng đo quang phổ (A260/A28). Chất lượng
ARN tốt nếu xuất hiện ba băng điện di tương ứng với 3 loại ARN 28S, 18S và
5,8S; tinh sạch nếu A260/A280 trong khoảng 1,8 – 2,0.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT                                                XỬ TRÍ

§  Lấy  mẫu  không  đủ  hoặc  sai  chất chống đông.

·   Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
§ Thao tác pipet không chính xác.       ·   Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
§ Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.     ·   Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
·   Thực hiện đúng, đủ các bước   trong quy trình xét nghiệm
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit
nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124-125.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research.  Springer Verlag, Berlin.

PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA (05 ĐỘT BIẾN)
PCR DETECTION OF ALPHA THALASEMIA GENE MUTATION (5
MUTATIONS)
 
I. NGUYÊN LÝ
Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Có rất nhiều loại đột biến gây bệnh anpha Thalassemia. Trong trường hợp này sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR là giải pháp tối ưu. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR. Như vậy chỉ cần một phản ứng Multiplex PCR chúng ta đã có thể phát hiện được nhiều đột biến cùng một lúc.
II. CHỈ ĐỊNH
Sử dụng cho tất cả người bệnh có chẩn đoán Alpha-Thalassemia.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy PCR;
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C;
- Găng tay.

2.2. Hóa chất
- Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối).
- Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi,
nước khử ion vô trùng.
- Các mồi đặc hiệu gồm 12 mồi để xác định đồng thời 5 đột biến mất đoạn; đồng thời cho biết tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến và 1 cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control). Theo bảng sau:
 
Mi Trình tự
SEA CF 5’ - CTC TGT GTT CTC CAG TAT TGG AGG GAA GGA G - 3’
SEA NR 5’ - TGA AGA GCC TGC AGG ACC AGG TCA GTG ACC G - 3’
SEA MR 5’ - ATA TAT GGG TCT GGA AGT GTA TCC CTC CCA - 3’
FIL MF 5’ - AAG AGA ATA AAC CAC CCA ATT TTT AAA TGG GCA - 3’
FIL MR 5’ - GAG ATA ATA ACC TTT ATC TGC CAC ATG TAG CAA - 3’
THAI MF 5’ - CAC GAG TAA AAC ATC AAG TAC ACT CCA GCC - 3’
THAI MR 5’ - TGG ATC TGC ACC TCT TGG GTA GGT TCT CTA CC - 3’
α2/3.7 F 5’ - CCC CTC GCC AAG TCC ACC C - 3’
3.7/20.5R 5’ - AAA GCA CTC TGA GGG TCC AGC G  - 3’
α2 R 5’ - AGA CCA GGA AGG GCC GGT G - 3’
4.2 R 5’ - CCC GTT GGA TCT TCT CAT TTC CC - 3’
4.2 F 5’ - GGT TTA CCC ATG TGG TGC CTC - 3’
- Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.
- Thuốc nhuộm ethidium bromide.
 
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
 
2.1. Tách chiết ADN
Xem bài “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”

2.2. Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện 5 đột biến bệnh alpha
thalassaemia.
 
STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ
1 H2O 5,5
2 2X GoTaq Green MM 12,5
3 DMSO 1,0
4 Hỗn hợp mồi 5,0
5 DNA 1,0
  Tổng thể tích 25,0
- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn
- Đặt vào máy PCR
- Chọn chương trình
- Bấm start để máy chạy
 
2.3 Điện di sản phẩm PCR
2.3.1. Chuẩn bị gel agarose
- Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
- Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.
- Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
- Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.
- Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
2.3.2. Điện di
- Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu  + 4 µl dH20
- Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự
- Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
- Đặt bản gel vào máy điện di
- Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
- Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết.
VII . NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                 XỬ TRÍ

§ Lấy  mẫu  không  đủ  hoặc  sai  chất chống đông.

§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.

§ Thao tác pipet không chính xác.          § Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
§ Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.           § Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến
cáo của nhà sản xuất
§ Thực  hiện  đúng, đủ  các bước trong quy trình xét nghiệm.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.   Chong et al., Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of a-thalassemia. Blood 2000;95:360–362.
2. Old JM DNA-based diagnosis of the hemoglobin disorders. In: Steinberg MH, Forget PG, Higgs DR, Nagel RL (eds) Disorders of Hemoglobin: Genetics, Pathophysiology, and Clinical Management. Cambridge University Press, Cambridge, UK(2001). pp 941-57.

KỸ THUẬT NESTED RT-PCR PHÁT HIỆN GEN LAI  BCR/ABL
NESTED RT-PCR DETECTION OF BCR/ABL FUSION GENE
 
 
 
I. NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật “ nested” RT-PCR dựa trên nguyên lý chung của kỹ thuật PCR: sử dụng hoạt tính tổng hợp ADN của enzym Taq-polymerase; cùng với các vật liệu cơ bản gồm các bazơ nitơ tự do (dNTPs), hai đoạn mồi: mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) để nhân bản đoạn gen quan tâm. Do đối tượng cần khuếch đại của kỹ thuật RT-PCR là ARN thông tin vì vậy phản ứng “nested” RT-PCR sẽ gồm có 3 bước cơ bản như sau:
Bước 1 -  RT ( reverse transcription -  phiên mã ngược): là bước chuyển đổi ARN sợi khuôn thành sợi ADN bổ trợ (ADNc), được thực hiện bởi enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase).
Bước 2 -  PCR vòng 1 : sử dụng sản phẩm của bước 1 làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR với sự tham gia của cặp mồi vòng ngoài (external primer) để nhân bản vùng gen có chứa trình tự gen đích BCR-ABL.
Bước 3 - PCR vòng 2: sản phẩm PCR vòng 1 được sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR lần 2 với sự tham gia của cặp mồi vòng trong (internal primer) để nhân bản chính xác đoạn gen đích.
II. CHỈ ĐỊNH
Sử dụng cho tất cả người bệnh có chẩn đoán CML/ALL/CLL.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy PCR;
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;
- Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C;
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
- Dung dịch Ficoll hoặc dung dịch ly giải tế bào hồng cầu gồm các muối
MgCl2, Tris-HCl, NaCl.
- Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
-  Hóa  chất  chạy  nested  RT-PCR:  kit  tổng  hợp  ADNc,  kit  RT-PCR onestep, PCR supermix. Nếu không sử dụng kit thương mại thì sử dụng các thành phần riêng lẻ như: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym phiên mã ngược, enzym kéo dài chuỗi, mồi oligodT hoặc mồi ngẫu nhiên (random primer), các cặp mồi đặc hiệu, nước khử ion vô trùng.
- Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml  máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Bước 1: Tách chiết ARN:
Xem bài “Tách chiết ARN từ máu ngoại vi/tủy xương
Bước 2: Thực hiện phản ứng RT-PCR vòng 1(thao tác ở 4oC)
- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.

- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống eppendorf 0,2 ml: master mix (đã bao gồm đệm, dNTPs, MgCl2), cặp mồi vòng ngoài, hỗn hợp enzym phiên mã ngược và enzym tổng hợp chuỗi (Taq-platinum), nước khử ion vô trùng,
ARN khuôn, được trình bày như bảng dưới đây:
 
STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ
1 Đệm 12,5
2 ARN 100 ng
3 Mồi xuôi (10pM/ µl) 1,0
4 Mồi ngược (10pM/ µl) 1,0
5 Taq-platinum 0,5 U
6 H2O Đủ thể tích 25 µl
  Tổng thể tích 25,0
 
 
- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn
- Đặt vào máy PCR
- Chọn chương trình
- Bấm start để máy chạy
Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR vòng 2 (thao tác ở 4oC)
- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.
- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống eppendorf 0,2 ml: Master mix (đã bao gồm đệm, dNTPs, MgCl2), cặp mồi vòng trong đặc hiệu cho tổ hợp gen BCR-ABL, enzym tổng hợp chuỗi, nước khử ion vô trùng, sản phẩm RT-PCR vòng 1, được trình bày như bảng dưới đây:
 
 
STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ
1 Đệm 12,5
2 Sản phẩm PCR vòng 1 1
3 Mồi xuôi (10pM/ µl) 1,0
4 Mồi ngược (10pM/ µl) 1,0
5 Enzym 0,5 U
5 H2O Đủ thể tích 25 µl
  Tổng thể tích 25,0

- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn;
- Đặt vào máy PCR;
- Chọn chương trình;
- Bấm start để máy chạy. Bước 4. Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:
-  Cân agarose cho vào bình đun gel (nồng độ 1% = 1gram/100ml);
-  Thêm đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình, lắc đều;
-  Đun sôi đến agarose tan hoàn toàn;
-  Để ấm đến 600C rồi đổ vào khay gel;
-  Để nhiệt độ phòng 30 phút để gel ổn định.
 Điện di:
-  Đặt gel vào khay điện di, đổ đầy đệm chạy và rút lược từ từ ra khỏi gel để tránh vỡ giếng;
-  Chuẩn bị hỗn hợp: 5µl sản phẩm PCR + 1 µl loading dye 10X + 4 µl
dH20.
-  Trộn đều và bơm vào các giếng theo thứ tự đã đánh dấu;
-  Sử dụng 3 µl ADN ladder để làm thang tính toán kích thước sản phẩm;
-  Điện di trong khoảng 30-40 phút, 110V;
-  Nhuộm bản gel với dung dịch Ethidium bromide trong 5 phút và soi, chụp ảnh trên đèn soi gel UV.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết .
Trong trường hợp sản phẩm PCR có băng không rõ ràng, nhiều băng không đặc hiệu hoặc đối chứng không chính xác thì phải lặp lại xét nghiệm. VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                XỬ TRÍ

§ Lấy  mẫu  không  đủ  hoặc  sai  chất chống đông.

§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.

§ Thao tác pipet không chính xác.          § Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.

§ Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.        § Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
§ Thực  hiện  đúng, đủ  các bước trong quy trình xét nghiệm.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit
nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124-125.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research.  Springer Verlag, Berlin.
3. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. StADNardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 1999;13,1901-28.

ĐNH LƢỢNG GEN BỆNH MÁU ÁC TÍNH BẰNG KỸ THUẬT REAL- TIME PCR
QUANTITATIVE REAL-TIME PCR OF GENES INVOLVED IN
MALIGNANT HEMATOPOIETIC DISEASES
 
 I. NGUYÊN LÝ
Sử dụng phương pháp Real-time-PCR định lượng ARNm của gen ung thư nhằm mục đích dự đoán thời điểm bệnh tái phát để ngăn chặn trước khi tái phát. Dựa trên sự kiểm soát lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng có thể xác định số lượng ARNm của gen ung thư tại thời điểm đó. Đồng thời trong phản ứng định lượng cùng lúc 2 gen: gen ung thư cần theo dõi và gen tham chiếu (housekeeping gen - là gen có tốc độ biểu hiện như nhau ở cả tế bào ung thư và tế bào lành) sẽ cho phép đánh giá mức độ hoạt động của gen ung thư so với gen tham chiếu ở cùng một thời điểm trong toàn bộ quá trình theo dõi thông qua tỷ lệ số lượng ARNm của gen ung thư/số lượng ARNm gen tham chiếu. Số lượng ARNm của gen ung thư tăng dần là đấu hiệu gen ung thư bắt đầu hoạt động trở lại.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định trước và trong suốt quá trình điều trị cho các người bệnh đang điều trị theo phác đồ nhắm đích.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1 Phương tiện
- Hệ thống máy real-time PCR
- Tủ hút hóa chất (chemical fume hood)
- Buồng vô trùng (biology cabinet).
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút).
- Máy vortex.
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl.
- Đầu côn có màng lọc.
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C.
- Găng tay.
 
2.2 Hóa chất
- Dung dịch Ficoll hoặc dung dịch ly giải tế bào hồng cầu gồm các muối
MgCl2, Tris-HCl, NaCl.
- Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Hóa chất cho phản ứng định lượng biểu hiện gen: kit thương mại. Nếu không sử dụng kit thương mại thì sử dụng các thành phần riêng lẻ như: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym phiên mã ngược, enzym kéo dài chuỗi, mồi oligodT hoặc mồi ngẫu nhiên (random primer), các cặp mồi và probe đặc hiệu, nước khử ion vô trùng.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ARN
Xem bài “Tách chiết ARN từ máu ngoại vi/tủy xương
 
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng ADNc
Sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotit (random hexamer primers) và enzym Reverse Transcriptase để chuyển hóa ARN thành ADN thông qua các chu trình nhiệt chuyên biệt.
Bƣớc 3: Thực hiện phản ứng real-time PCR
Chuẩn bị các mẫu chuẩn:
Mỗi loại gen cần định lượng phải có tối thiểu 3 mẫu chuẩn (mẫu chuẩn là các mẫu ARN đích đã biết trước nồng độ, thường sử dụng mẫu chuẩn ở 3 độ pha

loãng liên tiếp) và một mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm (thường sử dụng H20 đã khử các enzym phân hủy ADN và ARN hoặc đệm Tris- EDTA 1M, pH=7,5).
Chuẩn bị phản ứng:
- Ghi tên các ống theo thứ tự.
- Mỗi ống phản ứng bổ sung đủ các thành phần phản ứng:
+ Sản phẩm ADNc + master mix  theo nồng độ khuyến cáo (nếu sử dụng kit định lượng chế tạo sẵn).
+ Sản phẩm ADNc + buffer+ enzym+ primer+ probe theo đúng nồng độ đã tối ưu (nếu sử dụng các thành phần riêng lẻ).
- Đặt các ống phản ứng vào các vị trí trên máy. Chuẩn bị chương trình trên máy
- Cài đặt sơ đồ giếng theo đúng các vị trí ống đã đặt trên máy, nhập thông tin mẫu và các nồng độ mẫu chuẩn theo đúng yêu cầu, chọn kênh màu huỳnh quang tương thích.
- Cài đặt chương trình chạy theo chế độ luân nhiệt khuyến cáo của kit hoặc chế độ luân nhiệt đã tối ưu được.
- Chọn vị trí lưu kết quả sau khi kết thúc chương trình chạy.
- Bấm start để bắt đầu chạy theo chương trình đã chọn.
 Bƣớc 4: Phân tích kết quả
- Sau khi kết thúc chương trình chạy, tất cả các kết quả được hiển thị lên
màn hình.
- Kiểm tra các đường chuẩn và mẫu đối chứng âm trước.
+ Nếu đạt yêu cầu (theo hướng dẫn của kit sử dụng hoặc theo kết quả lý thuyết đã tối ưu) thì tiếp tục phân tích các mẫu khác theo kết quả thu được.
+ Nếu không đạt yêu cầu (mẫu chuẩn không có tín hiệu huỳnh quang, mẫu đối chứng âm bị nhiễm thành dương tính….) thì không đủ cơ sở để phân tích các mẫu khác. Trong trường hợp này phải lặp lại xét nghiệm sau khi đã tìm ra nguyên nhân sai sót ở xét nghiệm trước.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Nhận định kết quả theo các kết quả thu được bằng cách tính toán tỷ lệ
ARNm gen ung thư/ ARNm gen tham chiếu.
 
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                XỬ TRÍ

§   Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất
chống đông.

§   Thực hiện đúng hướng dẫn qui cách
lấy mẫu.

 
§   Thao tác pipet không chính xác.      §   Sử  dụng  pipet  theo  đúng  thể  tích quy định.
§   Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.    §   Bảo   quản   hóa   chất   đúng   theo khuyến cáo của nhà sản xuất
§   Thực   hiện   đúng,   đủ   các   bước trong quy trình xét nghiệm.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Hùng Vân (2009). Real-time PCR. PCR và Realtime PCR - các vấn đề cơ bản và các áp  dụng thường gặp. Nhà xuất bản y học, trang 60-65.
2. J Gabert et at (2003). Standardization and quality control studies of “real- time” quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia  - A Europe Agains Cancer
. Leukemia 17, 2318-2357.

XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN SỰ TỒN TẠI CỦA GEN BỆNH BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR
DISEASE GENE DETECTION BY REVERSE
TRANSCRIPTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION (RT- PCR)
 
 
 
I. NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật RT-PCR dựa trên nguyên lý chung của kỹ thuật PCR: sử dụng hoạt tính tổng hợp ADN của enzym Taq-polymerase; cùng với các vật liệu cơ bản gồm các bazơ nitơ tự do (dNTPs), hai đoạn mồi: mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) để nhân bản đoạn gen quan tâm. Do đối tượng cần khuếch đại của kỹ thuật RT-PCR là ARN thông tin vì vậy phản ứng RT- PCR sẽ gồm có 2 bước cơ bản như sau:
Bước 1 -  RT ( reverse transcription -  phiên mã ngược): là bước chuyển đổi ARN sợi khuôn thành sợi ADN bổ trợ (ADNc), được thực hiện bởi enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase).
Bước 2 -  PCR: sử dụng sản phẩm ADNc của bước 1 làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR với sự tham gia của cặp mồi đặc hiệu để nhân bản chính xác đoạn gen đích.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho tất cả các người bệnh mắc bệnh máu do các bất thường gen đặc hiệu.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy PCR;
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;
- Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C;
- Găng tay.
 
3.2. Hóa chất
- Dung dịch Ficoll hoặc dung dịch ly giải tế bào hồng cầu gồm các muối
MgCl2, Tris-HCl, NaCl.
- Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Hóa chất chạy RT-PCR: kit RT-PCR onestep. Nếu không sử dụng kit thương mại thì sử dụng các thành phần riêng lẻ như: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym phiên mã ngược, enzym kéo dài chuỗi, mồi oligodT hoặc mồi ngẫu nhiên (random primer), cặp mồi đặc hiệu, nước khử ion vô trùng.
- Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml  máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ARN:
Xem bài “Tách chiết ARN từ máu ngoại vi/tủy xương
Bước 2: Thực hiện phản ứng tổng hợp ADNc (thao tác ở 4oC)
Sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotit (random hexamer primers) và enzym Reverse Transcriptase để chuyển hóa ARN thành ADN thông qua các chu trình nhiệt chuyên biệt.

Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR (thao tác ở 4oC)
- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.
- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống eppendorf 0,2 ml: master mix (đã bao gồm đệm, dNTPs, MgCl2), cặp mồi cho gen đích, enzym tổng hợp chuỗi, nước khử ion vô trùng, sản phẩm ADNc, được trình bày như bảng dưới
đây:
 
STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ
1 Đệm 12,5
2 Sản phẩm ADNc 1
3 Mồi xuôi (10pM/ µl) 1,0
4 Mồi ngược (10pM/ µl) 1,0
5 Enzym 0,5 U
5 H2O Đủ thể tích 25 µl
  Tổng thể tích 25,0
 
 
- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn;
- Đặt vào máy PCR;
- Chọn chương trình;
- Bấm start để máy chạy. Bước 4: Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:
- Cân agarose cho vào bình đun gel (nồng độ 1% = 1gram/100ml);
- Thêm đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình, lắc đều;
- Đun sôi đến agarose tan hoàn toàn;
- Để ấm đến 600C rồi đổ vào khay gel;
- Để nhiệt độ phòng 30 phút để gel ổn định.
 
Điện di:
- Đặt gel vào khay điện di, đổ đầy đệm chạy và rút lược từ từ ra khỏi gel để tránh vỡ giếng;
- Chuẩn bị hỗn hợp: 5µl sản phẩm PCR + 1 µl loading dye 10X + 4 µl dH20;
- Trộn đều và bơm vào các giếng theo thứ tự đã đánh dấu;
- Sử dụng 3 µl ADN ladder để làm thang tính toán kích thước sản phẩm;

- Điện di trong khoảng 30-40 phút, 110V;
- Nhuộm bản gel với dung dịch Ethidium bromide trong 5 phút và soi,
chụp ảnh trên đèn soi gel UV.
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết .
Trong trường hợp sản phẩm PCR có băng không rõ ràng, nhiều băng không đặc hiệu hoặc đối chứng không chính xác thì phải lặp lại xét nghiệm. VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                XỬ TRÍ

§ Lấy  mẫu  không  đủ  hoặc  sai  chất chống đông.

§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.

§ Thao tác pipet không chính xác.          § Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
§ Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.        § Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
§ Thực  hiện  đúng, đủ  các bước trong quy trình xét nghiệm.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit
nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124-125.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research.  Springer Verlag, Berlin.
3. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 1999;13,1901-28.

PHÁT HIỆN GEN JAK2 V617F BẰNG KỸ THUẬT AS-PCR
DETECTION OF JAK2 V617F GENE MUTATION BY AS-PCR
 
I. NGUYÊN LÝ
Phát hiện đột biến JAK2 V617F (Janus Kinase Valin 617 Phenylalamin) trong các mẫu bệnh phẩm của người mắc hội chứng tăng sinh tủy mạn để góp phần chẩn đoán, xếp loại các bệnh đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu tiên phát, xơ tủy nguyên phát phục vụ cho điều trị bệnh.
Đột biến JAK2 V617F được phát hiện bằng kỹ thuật Allen-specific PCR (AS-PCR). Trong Allen-specific PCR (AS-PCR) người ta thiết kế một đoạn primer có trình tự sai khác so với trình tự đặc hiệu một nucleotide ở đầu 3’ để ngăn cản quá trình kéo dài chuỗi ADN của enzym Taq-polymeraza trong phản ứng PCR. Trong phương pháp này, người ta thiết kế hai ống phản PCR song song: ống phản thứ nhất sử dụng cặp primer đặc hiệu cho allen bình thường, ống phản ứng thứ hai sử dụng cặp primer để nhân bản allen đột biến. Phản ứng AS- PCR luôn có ít nhất một sản phẩm: nếu người bệnh dị hợp tử thì trong hai ống phản ứng PCR đều có một băng sản phẩm đặc hiệu, nếu người bệnh đồng hợp tử mang gen bệnh thì chỉ có ống phản ứng 2 có băng đặc hiệu, còn người bệnh đồng hợp tử bình thường thì chỉ ống phản ứng 1 có băng sản phẩm đặc hiệu.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả các người bệnh thuộc hội chứng tăng sinh tủy mạn.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1 Phương tiện
- Máy PCR
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh.
- Buồng vô trùng (biology cabinet).
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút).
- Máy vortex.
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl.
- Đầu côn có màng lọc.
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -20oC.
- Găng tay.
 
2.2 Hóa chất
- Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu.
- Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu toàn phần đựng trong ống chống đông EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ADN
Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.
 
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng AS-PCR
- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.
- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 ml:
 
Sinh phẩm Số lƣợng (µl)
Buffer 10X 2,5
dNTPs (500µM) 2
MgCl2 (25mM) 2

 
Primer F( bình thường/đột biến) 1
Primer R( bình thường/đột biến) 1
Enzym Taq 0,5
Nuclease free H2O 25 - x
ADN khuôn (100 ng) X
Tổng thể tích 25
(x: thể tích ADN đạt nồng độ 100 ng)
- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn
- Đặt vào máy PCR
- Chọn chương trình
- Bấm start để máy chạy. Bƣớc 3: Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:
- Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
- Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.
- Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
- Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.
- Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
 
Điện di:
- Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu 6X + 4 µl dH20
- Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự
- Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
- Đặt bản gel vào máy điện di
- Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
- Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                 XỬ TRÍ

§ Lấy  mẫu  không  đủ  hoặc  sai  chất chống đông.

§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.

§ Thao tác pipet không chính xác.          § Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.

§ Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.        § Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
§ Thực  hiện  đúng, đủ  các bước trong quy trình xét nghiệm.
 
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.  A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research.  Springer
Verlag, Berlin.
2.   Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ et at. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet
2005; 365:1054-61.

XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR
(Phát hiện cùng lúc nhiều đột biến)
MULTIPLE GENE MUTATIONS DETECTION BY MULTIPLEX PCR
 
 
 
I. NGUYÊN LÝ
Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Vì vậy, trong trường hợp bệnh do nhiều đột biến và cần xác định các đột biến này thì nên sử dụng kỹ Multiplex PCR. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR cho phép phát hiện được đồng thời nhiều đột biến.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả các người bệnh mắc bệnh máu do các đột biến gen.
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm Sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy PCR;
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-8oC, tủ âm sâu -20oC;
- Găng tay.
 
2.2. Hóa chất
- Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối).
- Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng.
- Các cặp mồi đặc hiệu cho các đột biến cần xác định và 1 cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control).
- Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.
- Thuốc nhuộm ethidium bromide.
 
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Bước 1. Tách chiết ADN
Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”
 
Bước 2. Thực hiện phản ứng Multiplex PCR
- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.
- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 ml: Buffer, dNTPs, MgCl2 (nếu trong Buffer chưa có), hỗn hợp mồi (gồm các cặp mồi phát hiện đột biến được trộn theo tỷ lệ nhất định), enzym Taq polymerase, nước khử ion vô trùng, ADN khuôn.
- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn.
- Đặt vào máy PCR.
- Chọn chương trình.
- Bấm start để máy chạy. Bước 3: Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:
-Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
- Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.
- Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
- Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.
- Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
 
Điện di:
- Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu  + 4 µl dH20
- Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự
- Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
- Đặt bản gel vào máy điện di
- Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
- Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút
 
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết.
VII . NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                XỬ TRÍ

§ Lấy  mẫu  không  đủ  hoặc  sai  chất chống đông.

§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.

§ Thao tác pipet không chính xác.          § Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
§ Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.        § Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
§ Thực  hiện  đúng, đủ  các bước trong quy trình xét nghiệm.
 
 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit
nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124-125.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research.  Springer Verlag, Berlin.

ĐNH LƢỢNG VIRUS CYTOMEGALO (CMV) BẰNG KỸ THUẬT
REAL-TIME PCR
 
 I. NGUYÊN LÝ
Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản một đoạn gen đặc trưng của virus CMV kết hợp với việc bổ sung taqman probe - là một chất phát huỳnh quang vào phản ứng PCR. Dựa vào sự kiểm soát số lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng cùng với các chuẩn ADN-CMV đã biết trước nồng độ, phần mềm của hệ thống sẽ tính toán và đếm được số lượng bản sao virus CMV ban đầu có trong mẫu bệnh phẩm.
II. CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này chỉ định cho tất cả các người bệnh có biểu hiện nhiễm
trùng sau ghép.
 
III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
 
IV. CHUẨN BỊ
1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
 
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
 
2.1. Phương tiện
- Hệ thống máy real-time PCR;
- Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-8oC, tủ âm sâu -20oC;
- Găng tay.
 
2.2 Hóa chất

- Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Kit định lượng CMV thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho phản ứng real-time PCR như probe, primer, dNTPs, enzym, các mẫu ADN chuẩn.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
 
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
V. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH
1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
 
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ADN
Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi” Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng Real-time PCR Chuẩn bị các mẫu chuẩn:
Để định lượng phải có tối thiểu 3 mẫu chuẩn (mẫu chuẩn là các mẫu ADN đích đã biết trước nồng độ, thường sử dụng mẫu chuẩn ở 3 độ pha loãng liên tiếp) và một mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm ((thường sử dụng H20 đã khử các enzym phân hủy ADN và ARN hoặc đệm Tris- EDTA 1M, pH=7,5). Chuẩn bị phản ứng:
- Ghi tên các ống theo thứ tự.
- Mỗi ống phản ứng bổ sung đủ các thành phần phản ứng:
+ Mẫu ADN + master mix   theo nồng độ khuyến cáo (nếu sử dụng kit định lượng chế tạo sẵn).
+ Mẫu ADN+ buffer+ enzym+ primer+ probe theo đúng nồng độ đã tối ưu (nếu sử dụng các thành phần riêng lẻ).
- Đặt các ống phản ứng vào các vị trí trên máy. Chuẩn bị chương trình trên máy
- Cài đặt sơ đồ giếng theo đúng các vị trí ống đã đặt trên máy, nhập thông tin mẫu và các nồng độ mẫu chuẩn theo đúng yêu cầu, chọn kênh màu huỳnh quang tương thích.
- Cài đặt chương trình chạy theo chế độ luân nhiệt khuyến cáo của kit hoặc chế độ luân nhiệt đã tối ưu được.
- Chọn vị trí lưu kết quả sau khi kết thúc chương trình chạy.
- Bấm start để bắt đầu chạy theo chương trình đã chọn.
 
Bƣớc 3: Phân tích kết quả
- Sau khi kết thúc chương trình chạy, tất cả các kết quả được hiển thị lên
màn hình.
- Kiểm tra các đường chuẩn và mẫu đối chứng âm trước.
+ Nếu đạt yêu cầu (theo hướng dẫn của kit sử dụng hoặc theo kết quả lý thuyết đã tối ưu) thì tiếp tục phân tích các mẫu khác theo kết quả thu được.
+ Nếu không đạt yêu cầu (mẫu chuẩn không có tín hiệu huỳnh quang, mẫu đối chứng âm bị nhiễm thành dương tính….) thì không đủ cơ sở để phân tích các mẫu khác. Trong trường hợp này phải lặp lại xét nghiệm sau khi đã tìm ra nguyên nhân sai sót ở xét nghiệm trước.
VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Số lượng virus CMV được hiển thị lên màn hình sau khi chạy, chú ý nhân với hệ số pha loãng mẫu  nếu trước đó có pha loãng mẫu để chạy.
VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
SAI SÓT                                                XỬ TRÍ

§ Lấy  mẫu  không  đủ  hoặc  sai chất chống đông.
§ Thao  tác  pipet  không  chính xác.
§ Tín  hiệu  phản  ứng  không  rõ
ràng.

§ Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
§ Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
 § Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
§ Thực  hiện  đúng,  đủ  các  bước  trong  quy
trình xét nghiệm.
 
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Hùng Vân (2009). Real-time PCR. PCR và Realtime PCR - các vấn đề cơ bản và các áp  dụng thường gặp. Nhà xuất bản y học, trang 60-65.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research.  Springer Verlag, Berlin.