Murex HIV Ag/Ab Combination

HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG “Murex HIV Ag/Ab Combination”

Xét nghiệm miễn dịch men phát hiện sớm giai đoạn chuyển đổi huyết thanh với HIV týp 1 (HIV1, HIV1 nhóm O) và phát hiện kháng thể kháng HIV2

I/ MỤC ĐÍCH SỬ DỤNG

Xét nghiệm miễn dịch men phát hiện sớm giai đoạn chuyển đổi huyết thanh với HIV týp 1 (HIV1, HIV1 nhóm O) và phát hiện kháng thể kháng HIV2

II/ TÓM TẮT VÀ GIẢI THÍCH XÉT NGHIỆM

Hai tuýp vi rút suy giảm miễn dịch người, HIV-1 và HIV-2 được miêu tả và liên quan như là tác nhân gây Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS). Cả hai đều là Retrovirus được lây truyền qua tiếp xúc với dịch cơ thể bị nhiễm bệnh nhất định, chủ yếu qua đường máu, đường tình dục và truyền từ mẹ sang con. Nhiễm HIV1 được báo cáo trên toàn thế giới. Nhiễm HIV2 được báo cáo xảy ra chủ yếu ở Tây Phi và một số nước Châu Âu.

Hai tuýp vi rút này cho thấy có phản ứng chéo kháng nguyên đáng kể trong protein lõi, nhưng glycoprotein vỏ ít phản ứng chéo hơn.

Việc sử dụng các quyết định kháng nguyên của các protein vỏ của 2 tuýp vi rút này là cần thiết cho mục đích sàng lọc, bổ sung cho phản ứng chéo chính giữa các protein lõi để đảm bảo phát hiện kháng thể kháng 2 tuýp vi rút trong tất cả các giai đoạn sau nhiễm. Các đột biến của HIV-1, đều được phân loại nhóm O, đã được xác định trong các mẫu thu thập từ Cameron và Châu Âu. Nhóm O có sự khác biệt rõ so với tuýp phụ đã biết của HIV-1 (được phân loại nhóm M). Các quyết định kháng nguyên đặc hiệu từ protein vỏ của vi rút này có thể được sử dụng để phát hiện các kháng thể kháng nhóm O trên từng cá thể nhiễm vi rút, sự phụ thuộc vào phản ứng chéo với các tuýp phụ đã biết của HIV là không đáng kể. Kháng thể đặc hiệu đáp ứng sớm nhất sau khi nhiễm HIV có thể là IgM, sau đó là đáp ứng của IgG. Độ nhạy lớn nhất trong việc phát hiện kháng thể kháng HIV giai đoạn chuyển đổi huyết thanh đạt được bởi thử nghiệm phát hiện cả kháng thể IgM và IgG trong khi kháng nguyên lõi của HIV thường phát hiện trong 1 thời gian ngắn trước khi chuyển đổi kháng thể.

Murex HIV Ag/Ab Combination được thiết kế để phát hiện kháng nguyên lõi HIV hoạt tính và kháng thể IgG, IgM và IgA kháng glycoprotein vỏ và protein lõi phản ứng chéo của HIV-1 và HIV-2. Do đó, các mẫu huyết thanh, mẫu huyết tương chứa EDTA hoặc citrate tiềm ẩn nhiễm vi rút có thể được xác định.

III/ NGUYÊN LÝ CỦA QUY TRÌNH

Nguyên lý của thử nghiệm Murex HIV Ag/Ab Combination dựa trên phiến vi lượng được phủ với 1 peptid tổng hợp đại diện cho vùng ưu thế miễn dịch của HIV-1 (O) và HIV-2, protein tái tổ hợp thu được từ protein vỏ của HIV-1 và HIV-2 và 1 protein lõi HIV, cùng với các kháng thể đơn dòng kháng p24 của HIV-1. Cộng hợp là hỗn hợp của các quyết định kháng nguyên giống nhau và kháng thể đơn dòng khác nhau kháng p24, cùng được dán nhãn với horseradish peroxidase.

Mẫu thử nghiệm và huyết thanh chứng được ủ trong giếng và kháng nguyên lõi HIV hoạt tính và/ hoặc kháng thể kháng HIV trong mẫu hoặc huyết thanh chứng liên kết với kháng thể và/hoặc kháng nguyên trên giếng; mẫu hoặc kháng thể thừa được loại bỏ qua bước rửa. Trong bước tiếp theo, cộng hợp được thêm vào và gắn với bất kỳ kháng nguyên HIV lõi hoạt tính và/ hoặc kháng thể đặc hiệu nào đã liên kết với thuốc thử trên giếng. Mẫu không chứa phản ứng kháng nguyên lõi hoặc kháng thể đặc hiệu sẽ không làm cho Cộng hợp gắn với giếng.

Cộng hợp không gắn được loại bỏ qua bước rửa và 1 dung dịch chứa 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) và hydrogen peroxide được thêm vào giếng. Giếng được gắn với Cộng hợp hình thành màu xanh, và chuyển thành màu cam khi phản ứng dừng lại bằng acid sulphuric. Màu được đọc trên máy quang phổ tại bước sóng 450 nm.

THUỐC THỬ

Tất cả các thành phần phải bảo quản ở 2-80C, trừ trường hợp quy định khác, ở điều kiện bảo quản này kít thử vẫn hoạt động đến hết hạn dùng.

1.      Giếng phủ

Một phiến (Hộp 96 test) hoặc 5 phiến (Hộp 480 test) chứa 96 giếng vi lượng đã phủ kháng nguyên HIV và các kháng thể đơn dòng

Đưa các giếng về nhiệt độ phòng (18-300C) trước khi lấy ra khỏi túi.

Đặt các giếng không sử dụng vào trong túi đựng, hàn kín và bảo quản ở 2-80C.

2.      Dung môi pha mẫu

Một chai chứa 8 mL (hộp 96 test) hoặc 18 mL (Hộp 480 test) dung dịch đệm màu xanh/màu nâu, protein bò và protein chuột, chất tẩy rửa và saponin; chứa 0.05% proClin® 300 chất bảo quản.

3.      Cộng hợp

Một chai (Hộp 96 test) hoặc 3 chai (Hộp 480 test) chứa 1.1 mL kháng nguyên HIV và các kháng thể đơn dòng cộng hợp với HRP và đông khô. Khi hoàn nguyên, mỗi chai đủ dùng cho 2 phiến.

4.      Dung môi pha cộng hợp

Một chai (Hộp 96 test) hoặc 3 chai (Hộp 480 test) chứa 22 ml dung dịch màu vàng gồm dung dịch đệm, protein bò, saponin và chất tẩy rửa, đủ để hoàn nguyên 1 chai cộng hợp. Chứa 0.1%  proClin® 300 chất bảo quản.

Hoàn nguyên cộng hợp:

Lấy chai Cộng hợp một cách nhẹ nhàng và loại bỏ bất kỳ nguyên liệu nào dính vào nút cao su. Đổ toàn bộ chai dung môi pha Cộng hợp vào chai Cộng hợp, đậy nắp và trộn bằng cách lắc nhẹ nhàng. Bù nước ít nhất 30 phút bằng cách thỉnh thoảng lắc xoáy. Cộng hợp sau hoàn nguyên có màu đỏ. Cộng hợp sau hoàn nguyên có thể gộp lại trong các chai nhựa dung môi Cộng hợp nếu cần thiết.

Sau khi hoàn nguyên Cộng hợp có thể bảo quản ở 2-80C đến 4 tuần.

5.      Huyết thanh chứng dương kháng thể kháng HIV1

Một chai chứa 1,7 mL huyết thanh người bất hoạt trong đệm chứa protein bò, có chứa 0.05% Bronidox chất bảo quản.

6.      Huyết thanh chứng dương kháng thể kháng HIV2

Một chai chứa 1,7 ml huyết thanh người bất hoạt trong dung dịch đệm có protein bò, chứa 0.05% Bronidox chất bảo quản.

7.      Chứng dương HIV1 p24

Một chai chứa 1,7 ml p24 (kháng nguyên tái tổ hợp) trong dung dịch đệm chứa protein bò, chứa 0.05% Bronidox chất bảo quản.

8.      Chứng âm

Hai chai chứa 2,5 ml huyết thanh người bình thường được pha loãng trong dung dịch đệm chứa protein bò, có chứa 0.05% Bronidox chất bảo quản.

9.      Dung môi pha cơ chất

Một chai chứa 35 ml dung dịch tri-natri citrate và hydrogen peroxide không màu

10.  Cơ chất đậm đặc

Một chai gồm 35 ml 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine  (TMB) và chất ổn định trong một dung dịch màu cam.

Dung dịch cơ chất

Để pha dung dịch cơ chất, thêm dung môi pha cơ chất không màu vào cùng thể tích dung dịch cơ chất đậm đặc màu cam trong cốc thủy tinh hoặc lọ nhựa sạch. Điều quan trọng là phải tuân thủ thứ tự quy trình và bất kỳ pi pét hay cốc thủy tinh được sử dụng để pha dung dịch cơ chất phải sạch.

Ngoài ra, có thể pha dung dịch cơ chất bằng cách đổ toàn bộ chai dung môi pha cơ chất vào chai cơ chất đậm đặc. Một chai dung dịch cơ chất đủ dùng làm thuốc thử cho ít nhất năm phiến – xem Bảng 1


Bảng 1: Thể tích của dung môi pha cơ chất và cơ chất đậm đặc theo yêu cầu

Số giếng Số phiến
8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 96 1 2 3 4
Cơ chất đậm đặc (ml)
0.5 1.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 4.5 6.0 6 12 18 22
Dung môi pha cơ chất (ml)
0.5 1.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 4.5 6.0 6 12 18 22

 

  • Thuốc thử bổ sung có thể được yêu cầu để sử dụng với máy tự động. Tránh ánh sáng mặt trời. Dung dịch cơ chất phải có màu vàng nhạt. Nếu dung dịch có màu xanh trước khi dùng thì nên loại bỏ và nên pha dung dịch cơ chất mới.
  • Dung dịch cơ chất được pha trong bộ kít này có thể được sử dụng thay thế cho dung dịch cơ chất của kít thử Murex khác có dùng cơ chất đậm đặc màu cam. Phải đảm bảo rằng dung dịch cơ chất được pha từ dung môi pha cơ chất và cơ chất đậm đặc được cung cấp trong cùng 1 bộ kít thử.
  • Dung dịch cơ chất đã được pha chế ổn định ở nhiệt độ 2-80C hoặc 15-250C trong vòng 2 ngày nhưng nếu hình thành tinh thể thì phải loại bỏ.

11.       Dung dịch rửa

Một chai (Hộp 96 test) hoặc 2 chai (Hộp 480 test) chứa 125 ml dung dịch rửa Glycine/Borate đậm đặc gấp 20 lần nồng độ hoạt động, chứa 0.2%  Bronidox® chất bảo quản.

Thêm 1 thể tích dung dịch rửa đậm đặc vào 19 thể tích nước cất hoặc nước khử ion để thu được thể tích theo yêu cầu hoặc pha loãng hoàn toàn 1 chai dung dịch rửa để được thể tích cuối cùng là 2500 mL. Có thể quan sát thấy tinh thể trong dung dịch rửa đậm đặc nhưng những tinh thể này sẽ bị hòa tan khi dung dịch rửa được pha loãng tới nồng độ hoạt động. Khi pha loãng dung dịch rửa chứa 0.01% Bronidox chất bảo quản

Dung dịch rửa của bộ kít thử này có thể được sử dụng thay thế cho dung dịch rửa Glycine/Borate của bất kỳ bộ kít thử Murex nào khác.

Dung dịch rửa ở nồng độ hoạt động bảo quản trong lọ kín ở nhiệt độ 18-300C ổn định trong 1 tháng.

Chú ý: Dung dịch rửa có thể chuyển thành màu vàng khi bảo quản. Điều này sẽ không ảnh hưởng đến hiệu năng của thử nghiệm.

Chú ý: Mặc dù dung dịch cơ chất và dung dịch rửa có thể dùng thay thế giữa các bộ kít thử Murex nhưng không được sử dụng khi hết hạn sử dụng in trên nhãn.

 

CẢNH BÁO VÀ THẬN TRỌNG

Thuốc thử chỉ dùng với mục đích chẩn đoán in vitro.

Chỉ dùng với mục đích chuyên môn.

Hãy tham khảo bảng dữ liệu an toàn của nhà sản xuất và thông tin về thành phần tiềm ẩn nguy hiểm trên nhãn sản phẩm.

Các mức thấp của tủa fibrin có thể quan sát thấy trong các bộ Kit chứng và không ảnh hưởng đến hiệu năng của sản phẩm. Đây là sản phẩm cố định của 1 số lô huyết thanh sử dụng để sản xuất các mẫu chứng.

THÔNG TIN AN TOÀN VÀ SỨC KHỎE

THẬN TRỌNG: Bộ kít thử này chứa các thành phần có nguồn gốc từ người.

Nhà sản xuất sử dụng huyết thanh người đã được sàng lọc và cho phản ứng hoặc không phản ứng với các chất phân tích được trình bảy trong Bảng 2 dưới đây:

Bảng 2:

Thành phần Phản ứng với Không phản ứng với
Chứng âm N/A HBsAg, kháng thể kháng HCV, HIV1 và HIV2
Chứng dương 1 Kháng thể kháng HIV1 HBsAg
Chứng dương 2 Kháng thể kháng HIV2 HBsAg
  • Ngoài ra, huyết thanh người sử dụng làm chứng dương cũng được thử nghiệm với kháng thể kháng HCV và có thể cho phản ứng.
  • Tất cả huyết thanh phản ứng được sử dụng đều được bất hoạt trước khi dùng trong pha chế thuốc thử. Tuy nhiên, tất cả nguyên liệu có nguồn gốc từ người nên được coi là chất tiềm ẩn gây bệnh. Mẫu xét nghiệm và bộ kít thử được khuyến cáo xử lý theo thực hành tốt phòng thí nghiệm.
  • Dung môi pha mẫu chứa 0.05% proClin® 300, dung môi pha cộng hợp và cộng hợp hoàn nguyên chứa 0.1% proClin® 300 là chất được Cộng đồng kinh tế Châu Âu (EEC) xếp loại là chất kích thích (Xi). Dưới đây là những thuật ngữ: Nguy hiểm (R) và An toàn (S)

R43: Có thể gây kích thích qua tiếp xúc với da

S24: Tránh tiếp xúc với da.

S35: Nguyên liệu này và vỏ đựng phải được loại bỏ một cách an toàn

S37: Đeo găng tay thích hợp

S46: Nếu nuốt, hãy đến chuyên khoa y tế ngay lập tức và đưa họ vỏ & nhãn.

Thông tin dành cho khách hàng Châu Âu: Với sản phẩm không xếp loại là chất nguy hiểm theo European  Directive  1999/45/EC – Bảng dữ liệu an toàn phải có sẵn cho mục đích chuyên môn theo yêu cầu.

  1. Nguyên liệu có khả năng lây nhiễm phải được xử lý an toàn theo yêu cầu địa phương.
  2. Nguyên liệu có khả năng lây nhiễm bị đổ phải loại bỏ ngay bằng giấy thấm và vùng bị bẩn phải được lau, ví dụ bằng natri hypochloride 1.0% trước khi tiếp tục làm việc. Natri hypochloride không nên được sử dụng trong trường hợp acid đổ tràn trừ khi vùng đổ tràn đã được lau khô đầu tiên. Các vật liệu được dùng để lau, bao gồm găng tay nên được loại bỏ như chất thải sinh học nguy cơ tiểm ẩn. Không dùng nồi hấp vật liệu chứa natri hypochloride.
  3. Acid trung hòa hay chất thải lỏng khác nên được khử nhiễm bằng cách thêm 1 thể tích thích hợp của natri hypochloride để thu được nồng độ cuối cùng ít nhất là 1,0%. 30 phút phơi nhiễm với natri hypochloride là cần thiết để đảm bảo sự khử nhiễm có hiệu quả.
  4. Không dùng pi pét bằng miệng. Đeo găng tay và kính bảo vệ mắt khi xử lý mẫu và thực hành thử nghiệm. Rửa sạch tay sau khi hoàn thành.
  5. Nếu bất kỳ thuốc thử nào bị rây vào da hoặc mắt, hãy rửa sạch toàn bộ vùng bị rây với nước.
  6. Acid sulphuric yêu cầu cho dung dịch dừng phản ứng và acid hydrochloric dùng để  rửa đồ thủy tinh có tính chất ăn mòn và nên được xử lý cẩn thận. Nếu tiếp xúc với da hoặc mắt, phải rửa sạch bằng nước.

THẬN TRỌNG

  1. Không dùng thuốc thử khi hết hạn sử dụng. Phải tránh lây nhiễm vi sinh học thuốc thử vì nó có thể giảm hạn dùng của thuốc thử và gây kết quả sai.
  2. Không thay đổi quy trình thử nghiệm hoặc sử dụng thuốc thử của nhà sản xuất khác hoặc lô khác trừ trường hợp thuốc thử được quy định là được phép hoán đổi. Không giảm thời gian ủ khuyến cáo.
  3. Để tất cả thuốc thử và mẫu về nhiệt độ 18-300C trước khi sử dụng. Ngay khi dùng xong, đưa thuốc thử về nhiệt độ bảo quản khuyến cáo.
  4. Bất kỳ đồ thủy tinh nào được sử dụng với thuốc thử phải được rửa sạch với acid hydrochlorid 2M và sau đó tráng qua nước cất hoặc nước khử ion chất lượng cao.
  5. Tránh dùng tủ lạnh tự phá băng để bảo quản thuốc thử và mẫu.
  6. Không được để thuốc thử tiếp xúc với ánh sáng mạnh hoặc khói hypochloride trong khi bảo quản và trong các bước ủ.
  7. Không được để giếng khô trong khi tiến hành thử nghiệm.
  8. Không được để lây nhiễm chéo giữa các thuốc thử. Dành 1 pi pét để sử dụng cho dung dịch cơ chất của thử nghiệm Murex. Cũng dành riêng 1 pi pét để sử dụng cho chất cộng hợp.
  9. Dung dịch mẫu trong thử nghiệm có tiềm ẩn khản năng gây dương tính giả trên thử nghiệm kháng kháng nguyên bề mặt viêm gan B (anti-HBs) nếu xảy ra nhiễm chéo thuốc thử.

Nếu tiến hành thử nghiệm Murex HIV Ag/Ab Combination cùng với thử nghiệm kháng HBs trên một đầu thiết bị cố định phải đảm bảo loại trừ khả năng nhiễm chéo trong suốt quá trình thử nghiệm.

  1. Không chạm hay làm bắn Cộng hợp lên vành giếng. Không được thổi khi dùng micropipette, nên đảo ngược pi pét nếu có thể.
  2.  Đảm bảo đáy phiến sạch và khô, không có bọt khí trên bề mặt chất lỏng khi đọc kết quả.
  3.  Không được để bụi hay găng tay dùng 1 lần lây nhiễm giếng vi lượng.
  4.  Khi dùng máy hoàn toàn tự động:
  • Không cần đậy phiến và làm khô giếng.
  • Không được để chất lỏng từ hệ thống gây nhiễm mẫu và thuốc thử.
  • Khả năng nhiễm chéo giữa các thử nghiệm cần được loại trừ khi thẩm định thử nghiệm trên máy hoàn toàn tự động.
  1. Đảm bảo thử nghiệm được chạy trong giới hạn nhiệt độ được quy định trong đề cương thử nghiệm.
  2. Không dùng nồi hấp CO2.
  3. Không bảo quản dung dịch dừng phản ứng trong đĩa nông hoặc đổ lại vào chai sau khi sử dụng.
  4. Khả năng nhiễm chéo giữa các thử nghiệm cần được loại trừ khi thẩm định đề cương thử nghiệm trên thiết bị.

THU THẬP MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN

THU THẬP MẪU:

Huyết thanh hay mẫu huyết tương có citrate hoặc EDTA đều có thể sử dụng. Đảm bảo các mẫu huyết thanh đều được ngưng đọng hoàn toàn. Ly tâm để loại bỏ bất kỳ tiểu phân nào có trong mẫu. Nếu mẫu được chuẩn bị có sử dụng các chất chống đông lỏng như: huyết tương chứa citrate, nên xem xét hiệu quả pha loãng.

VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU

Bảo quản mẫu ở 2-80C. Các mẫu chưa thử nghiệm trong vòng 72 giờ phải loại bỏ cục máu đông, mảnh tế bào và bảo quản ở nhiệt độ đông băng (-15°C hoặc lạnh hơn). Tránh nhiều chu kỳ tan băng và đông băng. Mẫu sau khi rã đông phải đảm bảo được trộn kỹ trước khi xét nghiệm.

QUY TRÌNH

VẬT LIỆU CẦN NHƯNG KHÔNG ĐƯỢC CUNG CẤP TRONG KÍT THỬ

  1. Dung dịch dừng phản ứng (Acid sulfuric 0,5-2M), ví dụ thêm từ 3ml (0,5M) và 11ml (2M) acid sulphuric đậm đặc (18M) vào 80ml nước cất hoặc nước khử ion sau đó thêm nước cho vừa đủ 100ml. Ngoài ra có thể sử dụng thuốc thử sau: Acid sulphuric 1N.
  2. Nước cất tinh khiết hoặc nước khử ion chất lượng cao: dùng để pha loãng dung dịch rửa, pha dung dịch dừng phản ứng và dùng phối hợp với máy rửa tự động.
  3. Micropipet và Micropipet đa kênh với thể tích thích hợp
  4. Tủ ấm có khả năng duy trì giới hạn nhiệt độ được quy định trong đề cương thử nghiệm.
  5. Bộ gia nhiệt: dùng trong tủ ấm phòng thí nghiệm. Tốt nhất là bộ gia nhiệt nên để trong tủ ấm khi sử dụng. Nếu không, phải để trong tủ ấm ít nhất 4 giờ trước khi xét nghiệm.
  6. Thiết bị:  Máy rửa phiến vi lượng tự động, Máy đọc Hoặc Máy hoàn toàn tự động

Tất cả thiết bị phải được thẩm định trước khi sử dụng

Hãy liên hệ với nhà cung cấp để biết thêm chi tiết về thiết bị khuyên dùng, phần mềm cài đặt thiết bị và quy trình thẩm định.

  1. Khay thuốc thử dùng 1 lần
  2. Natri hypochloride: dùng khử nhiễm (Tham khảo phần Thông tin an toàn và sức khỏe)
  3. Dung dịch Natri hydroxide 0,1M (Tham khảo phần Thận trọng)

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM

Đọc kỹ phần Thận trọng trước khi tiến hành xét nghiệm.

Khi nhỏ nhiều thành phần khác nhau của thử nghiệm vào giếng, có thể được xác nhận bằng mắt thường bằng cách kiểm tra phiến theo các màu dưới đây:

  • Dung môi pha mẫu: màu xanh/màu nâu. Khi thêm mẫu hoặc chứng, màu chuyển thành màu xanh da trời/xanh lá cây. Sự thay đổi màu khác nhau tùy theo mẫu nhưng một số sự thay đổi luôn quan sát được. Khi thêm mẫu hoặc chứng có thể xác nhận bằng máy đọc ở bước sóng 570 hoặc 620 nm, tham chiếu tại 690nm.
  • Cộng hợp sau hoàn nguyên có màu đỏ. Khi thêm Cộng hợp có thể xác nhận bằng máy đọc ở bước sóng 450 nm, tham chiếu tại 690 nm
  • Dung dịch cơ chất ban đầu có màu vàng nhạt khi thêm vào giếng, phản ứng thì trở thành màu xanh. Khi thêm dung dịch dừng phản ứng, nếu dương tính thì màu xanh chuyển sang màu cam trong khi đó nếu âm tính sẽ chuyển sang màu hồng. Khi thêm dung dịch cơ chất có thể xác nhận bằng máy đọc ở 450 nm (không tham chiếu)

QUY TRÌNH BÁN TỰ ĐỘNG

Bước 1 Hoàn nguyên và trộn đều Cộng hợp, pha dung dịch cơ chất và dung dịch rửa
Bước 2 Chỉ sử dụng số giếng theo yêu cầu xét nghiệm. Tránh chạm vào miệng và đáy giếng.
Bước 3 Nhỏ 25 µl dung môi pha mẫu vào từng giếng 25 µl
Bước 4 Nhỏ 100 µl mẫu hoặc chứng vào giếng

Đối với mỗi phiến, cột giếng đầu tiên được dùng để xét nghiệm các Chứng. Nhỏ chứng vào các giếng được chỉ định sau khi đã nhỏ mẫu. Nhỏ 100 µl chứng âm vào từng giếng trong 3 giếng từ A1-C1 và nhỏ 100 µl chứng dương P24, anti-HIV-1 và anti-HIV-2, p24 tương ứng vào giếng D1 đến F1.

Sử dụng một nền trắng hỗ trợ hiển thị mẫu thêm vào.

100 µl
Bước 5: Phủ kín giếng bằng nắp đậy và ủ trong 60 phút ở nhiệt độ 37°C ±1°C. 60 phút
Bước 6: Kết thúc thời gian ủ, rửa phiến theo như miêu tả trong Quy trình rửa
Bước 7: Ngay sau khi rửa phiến, nhỏ 100 µl Cộng hợp vào từng giếng 100 µl
Bước 8 Phủ kín giếng bằng nắp đậy và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37°C ±1°C. 30 phút
Bước 9: Kết thúc thời gian ủ, rửa phiến theo như miêu tả trong Quy trình rửa
Bước 10: Ngay sau khi rửa phiến, nhỏ 100 µl dung dịch cơ chất vào từng giếng 100 µl
Bước 11: Phủ kín giếng bằng nắp đậy và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 37°C ±1°C.

Tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời. Nếu mẫu phản ứng, hình thành màu xanh trong giếng.

30 phút
Bước 12: Nhỏ 50 µl dung dịch dừng phản ứng (acid sulphuric 0.5M -2M) vào từng giếng 50 µl
Bước 13: Trong vòng 15 phút, đọc độ hấp thụ ở bước sóng 450nm, tham chiếu ở bước sóng  620-690nm (nếu cần)

Đặt thiết bị trong phòng (không có phiến trong quá trình vận chuyển)

QUY TRÌNH RỬA

Đề cương khuyến cáo cho máy rửa và quy trình xác minh máy rửa và dụng cụ phân tích có thể có được từ nhà cung cấp. Đề cương dưới đây được khuyến cáo:

Đề cương cho máy rửa phiến vi lượng tự động:

Thực hiện 5 chu kỳ rửa bằng dung dịch rửa ở nồng độ hoạt động. Đảm bảo, nếu có thể:

  • Khi dùng thiết bị do Diasorin cung cấp, lưu lượng nước rửa làm đầy giếng 500 µl/giếng. Nếu dùng thiết bị khác, phải đảm bảo các giếng hoàn toàn đầy.
  • Thiết lập chiều cao phân phối dung dịch để giếng hoàn toàn đầy với sự tạo thành mặt khum, không làm tràn.
  • Thời gian để hoàn thành 1 chu kỳ hút/rửa/ngâm là khoảng 30 giây.
  • Đảm bảo rằng không có chất lỏng nào còn lại trong giếng (dùng bước hút gấp đôi trong chu kỳ cuối nếu có thể).
  • Sau khi quy trình rửa hoàn thành, quay ngược phiến và thấm dung dịch rửa thừa lên giấy thấm.

CHÚ Ý: Không được làm giếng khô trong quá trình xét nghiệm.

Máy rửa phải được rửa sạch bằng nước cất sau khi hoàn thành thử nghiệm để tránh tắc và ăn mòn.

Quy trình đối với máy hoàn toàn tự động

Hãy liên hệ với nhà cung cấp chi tiết về các đề cương đã được thẩm định hiện hành. Với những thiết bị không ban hành đề cương thẩm định, hướng dẫn sau được khuyến cáo:

  1. Không rút ngắn chương trình chạy xét nghiệm so với quy định.
  2. Mỗi lần ủ ở 370C, thời gian ủ có thể tăng lên 5 phút.
  3. Các giếng chứa dung môi pha mẫu có thể để ở nhiệt độ 18 – 30°C trong vòng 60 phút trước khi nhỏ mẫu và 60 phút sau khi nhỏ mẫu hoặc chứng trước khi bắt đầu Bước 5.
  4. Đảm bảo tuân thủ phần Thận trọng

Các đề cương được viết theo các hướng dẫn này phải thẩm định đầy đủ trước khi sử dụng theo quy trình.

KẾT QUẢ

TÍNH KẾT QUẢ

Mỗi phiến phải được xem xét riêng khi tính và nhận định kết quả của thử nghiệm.

Có thể sử dụng phần mềm đã được phê chuẩn để tính và giải thích kết quả.

Chứng âm:

Tính độ hấp thụ trung bình của các chứng âm.

Ví dụ:

Giếng 1= 0,084; Giếng 2 = 0,086; Giếng 3= 0,070. Tổng = 0,240

Chứng âm trung bình = 0,240/3 = 0,080

Nếu 1 trong các giếng chứng âm có độ hấp thụ lớn hơn 0,15 O.D. so với giá trị trung bình trên của cả 3 giếng thì loại bỏ giá trị đó và tính giá trị trung bình mới của chứng âm từ 2 giếng còn lại.

Giá trị ngưỡng

Tính giá trị ngưỡng = giá trị trung bình của chứng âm (ở phần trên) + 0,150

Giá trị chứng âm trung bình = 0,080

Giá trị ngưỡng = 0,080 + 0,150 = 0,230.

 

KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG

Kết quả của thử nghiệm có giá trị nếu các chứng thỏa mãn tiêu chuẩn sau:

Chứng âm:

Độ hấp thụ trung bình phải nhỏ hơn 0,15.

Chứng dương:

Độ hấp thụ của mỗi chứng dương phải lớn hơn 0,8 so với độ hấp thụ trung bình của chứng âm.

Thử nghiệm không đạt tiêu chuẩn này phải tiến hành thử lại.

Trong trường hợp không chắc chắn về kết quả lặp lại không đạt tiêu chuẩn kiểm định chất lượng hoặc không đáp ứng như hiệu năng mong đợi của thử nghiệm, hãy liên hệ với nhà cung cấp 

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Kết quả không phản ứng:

Mẫu có độ hấp thụ dưới Giá trị ngưỡng được xem là âm tính.

Kết quả phản ứng

  • Mẫu có độ hấp thụ bằng hoặc lớn hơn giá trị ngưỡng được xem là có phản ứng ban đầu. (xem phần giới hạn quy trình)
  • Những mẫu đó phải xét nghiệm lặp lại 2 lần sử dụng nguyên liệu ban đầu, trừ quy định khác.
  • Những mẫu phản ứng ít nhất 1 trong 2 lần xét nghiệm lặp lại được nhận định là phản ứng lặp lại với Murex HIV Ag/Ab Combination và được xem là có kháng nguyên lõi và/ hoặc kháng thể kháng HIV-1 hoặc HIV-2. Những mẫu như vậy nên được nghiên cứu sâu hơn và các kết quả của thử nghiệm này được xem xét với bất kỳ thông tin lâm sàng và/ hoặc thử nghiệm nào. Các mẫu không phản ứng ở cả 2 giếng xét nghiệm lặp lại được xem là không phản ứng với kháng nguyên lõi và kháng thể HIV.

Không nhỏ mẫu

Các giếng thu được giá trị độ hấp thụ cao hơn đáng kể so với chứng âm có thể không cần nhỏ mẫu nhưng đều được nhỏ tất cả các thuốc thử.

ĐẶC TÍNH HIỆU NĂNG

Hiệu năng của Murex HIV Ag/Ab Combination được xác định bằng các mẫu thử nghiệm ngẫu nhiên trên người tình nguyện hiến máu, những bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh AIDS theo tiêu chuẩn CDC, bệnh nhân trong giai đoạn phức hợp liên quan đến AIDS (ARC), bệnh nhân khác có kháng thể đã biết kháng HIV-1 (bao gồm nhóm O), bệnh nhân được khẳng định nhiễm HIV-2 và bệnh nhân có nguy cơ nhiễm HIV hoặc có những triệu chứng lâm sàng khác. Ngoài ra, hiệu năng của thử nghiệm được đánh giá trên các panel chuyển đổi huyết thanh thương mại có sẵn.

Độ nhạy chẩn đoán

497 mẫu bệnh nhân được khẳng định bị nhiễm HIV-1 đã được thử nghiệm và phát hiện có phản ứng với Murex HIV Ag/Ab Combination. Các mẫu được lấy từ bệnh nhân nhiễm HIV ở các giai đoạn khác nhau và bao gồm 24 mẫu lấy từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 nhóm O và 139 mẫu từ bệnh nhân nhiễm HIV-1 khác nhóm phụ B.

Ngoài ra, có 100 mẫu bệnh nhân được khẳng định nhiễm HIV-2 cũng được thử nghiệm với Murex HIV Ag/Ab Combination và cho phản ứng.

Độ nhạy chẩn đoán của Murex HIV Ag/Ab Combination trên nhóm mẫu này được ước tính là 100% (597/597) với độ tin cậy dưới 95% 99,38% (593/597) bằng hàm phân phối nhị thức.

Tổng số 26 panel chuyển đổi huyết thanh HIV-1 cũng được thử nghiệm với Murex HIV Ag/Ab Combination. Phương pháp tham chiếu là Western Blot có sử dụng protein lõi (p24) và glycoprotein vỏ (gp120/160), Murex HIV Ag/Ab Combination phát hiện kháng thể HIV sớm hơn hoặc bằng so với phương pháp Western Blot trên tất cả các panel.

Độ đặc hiệu chẩn đoán

Thử nghiệm Murex HIV Ag/Ab Combination được chứng minh có độ đặc hiệu trên 99.5% trong 1 nghiên cứu thử nghiệm với các mẫu thu được từ máu người Châu Âu tình nguyện. Tổng số 9290 mẫu huyết thanh tình nguyện được sàng lọc với Murex HIV Ag/Ab Combination tại 3 trung tâm huyết học truyền máu. Các kết quả được tóm tắt trong Bảng 3. Trong nghiên cứu này, 99,77% (9269/9290) mẫu không phản ứng và 0,23% (21/9290) có phản ứng lặp lại. Một trong những mẫu phản ứng lặp lại có dương tính nhưng yếu với Murex HIV Antigen mAb (8E77). Không có mẫu nào trong 20 mẫu còn lại được khẳng định là dương tính với sự có mặt của kháng nguyên HIV-1 hoặc kháng thể kháng HIV-1 hoặc HIV-2.

Độ đặc hiệu của Murex HIV Ag/Ab Combination trên những mẫu âm tính thu thập từ người tình nguyện hiến máu tại Châu Âu được ước tính là 99,78% (9269/9289) với khoảng tin cậy 95% từ 99,67%(9258/9289) đến 99,87% (9277/9289) bằng hàm phân phối nhị thức.

Tổng số 267 mẫu bệnh nhân không nhiễm HIV cũng được xét nghiệm với Murex HIV Ag/Ab Combination. Những mẫu này bao gồm mẫu thu được từ những phụ nữ mang thai và bệnh nhân bị bệnh tự miễn và các bệnh do nhiễm cấp tính các virus khác. Tổng số 5 mẫu có phản ứng với Murex HIV Ag/Ab, 4 có phản ứng với 2 xét nghiệm sàng lọc có sẵn. Trong nghiên cứu Western Blot có 4 kết quả không xác định và 1 kết quả âm tính.

Ngoài ra, 38 mẫu bệnh nhân bị lipid máu, vàng da và tan huyết cũng được xét nghiệm và cho kết quả không phản ứng.

Độ đặc hiệu chẩn đoán của Murex HIV Ag/Ab Combination trong việc ước tính hiệu năng trên các mẫu đã được xác định là âm tính được ước tính là 99,78% (9569/9590) với khoảng tin cậy 95% từ 99,67% (9558/9590) đến 99,86% (9577/9590) bằn hàm phân phối nhị thức.

Độ lặp lại của thử nghiệm

Độ lặp lại của thử nghiệm Murex HIV Ag/Ab Combination được đánh giá bằng việc thử nghiệm 2 trong các chứng thử nghiệm và 4 panel thành viên có chất lượng đảm bảo và lặp lại 10 lần trên 4 kỳ khác nhau. Các kết quả thử nghiệm được tóm tắt trong bảng 4.

Bảng 3:

Phản ứng của Murex HIV Ag/Ab Combination với mẫu máu âm tính từ người Châu Âu tình nguyện

Trung tâm Số mẫu âm tính thử nghiệm Số mẫu phản ứng lặp lại
A 3095 6a (0.19%)
B 2803 9 (0.32%)
C 3392 6 (0.18%0
Tổng 9290 21 (0.23%)

a gồm 1 mẫu dương tính yếu với Murex HIV Antigen mAb

Bảng 4:

Murex  HIV Ag/Ab Combination – Độ lặp lại thử nghiệm

Mẫu Số thử nghiệm Số lần lặp lại Độ hấp thụ trung bình/Tỷ lệ ngưỡng Thử nghiệm intra  % CV Thử nghiệm inter  % CV
Chứng âm 4 10 0.266 8.7 11.3
Chứng dương HIV1 4 10 8.287 4.3 4.7
QA01 4 10 3.672 4.6 7.3
QA02 4 10 4.696 5.6 12.9
QA03 4 10 3.006 3.9 4.2
QA04 4 10 1.663 6.8 9.2

 

Độ nhạy trên chuẩn AFSSAPS HIV Ag

Độ nhạy của Murex HIV Ag/Ab Combination trên chuẩn AFSSAPS HIV Ag được xác định tại 3 trung tâm thử nghiệm.

Bảng 5

Độ nhạy trên chuẩn AFSSAPS HIV Ag

Trung tâm Độ nhạy HIV Ag pg/ml
1 31
2 28
3 25
Trung bình 28

Dữ liệu chỉ ra ở bảng 5 thu được trong quá trình thử nghiệm nhưng có thể không lặp lại chính xác trong các kỳ thử nghiệm khác.

GIỚI HẠN QUY TRÌNH

  1. Phải tuân theo Quy trình xét nghiệm và Nhận định kết quả.
  2. Thử nghiệm này chỉ được đánh giá sử dụng trên mẫu huyết thanh riêng lẻ, mẫu huyết tương citrate và mẫu huyết tương EDTA.
  3. Một kết quả âm tính với thử nghiệm phát hiện kháng nguyên/kháng thể không loại trừ khả năng nhiễm vi rút HIV.
  4. Kết quả dương tính với Murex HIV Ag/Ab Combination nên được xác định bởi ít nhất 1 thử nghiệm khác.
  5. Kết quả phản ứng không lặp lại có thể gặp với bất kỳ quy trình của thử nghiệm miễn dịch men nào.

Nguyên nhân gây lỗi thường gặp nhất:

  • Nhỏ mẫu, cộng hợp hoặc cơ chất vào giếng không chính xác.
  • Nhiễm Cơ chất với Cộng hợp.
  • Nhiễm Cộng hợp từ các thử nghiệm khác.
  • Bị tắc hoặc bị dò từng phần máy rửa.
  • Còn một lượng nhỏ dung dịch rửa trong giếng vì hút chưa đủ.
  • Bề mặt dưới của giếng không được đảm bảo sạch và khô và không đảm bảo không có bọt khí trên bề mặt chất lỏng trước khi đọc phiến.
  • Không đọc tại bước sóng chính xác (450 nm) hoặc sử dụng bước sóng tham chiếu không thích hợp (không phải 620 nm đên 690 nm).
  1. Việc sử dụng mẫu ly giải cao, huyết thanh không ngưng đọng hoàn toàn, mẫu huyết tương chứa fibrin hoặc mẫu nhiễm khuẩn có thể cho kết quả sai.
  2. Kít thử này chưa được đánh giá trên mẫu tử thi.

Tài liệu tham khảo

  1. Clavel, F. (1987). HIV-2: the West African Aids virus. AIDS, 1, 135.
  2. Simon, F. et al. (1998) Nat. Med., 4, 1032. Identification of a new human immunodeficiency virus type 1 distinct from group M and group O.
  3. Denis,  F.,  Leonard,  G. et  al.  (1988).  Comparison  of  10  enzyme immunoassays for the detection of antibody to human immunodeficiency virus type 2 in West African sera. J. Clin. Microbiol., 26, 1000.
  4. Vanden Haesevelde, M., Decourt, J. et al. (1994). Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immunodeficiency virus isolate. J. Virol. 68, 1586.
  5. Gürtler, L.G., Hauser, P.H.  et al. (1994). A new subtype of human immunodeficiency virus type 1 (MVP-5180) from Cameroon. J. Virol. 68., 1581.
  6. Loussert-Ajaka, I., ly, T.D. et al., (1994). HIV-1/HIV-2 seronegativity in HIV subtype O infected patients. Lancet, 343, 1393.
  7. Gains, H., von Sydons, H., et al., (1988). Detection of immunoglobulin M antibody in primary human immunodeficiency virus infection. AIDS, 2, 11.
  8. Centres for Disease Control (1985). recommendations for preventing transmission  of  infection  with  human  T-lymphotropic  virus  type III/lymphadenopathy-associated virus in the workplace. MMWr, 34, No. 45, 681.

Bảo quản: Bảo quản từ 2-80C

Đóng gói: Hộp 96 test, Hộp 480 test.

Hạn dùng: 12 tháng kể từ ngày sản xuất

Nhà sản xuất: DiaSorin S.p.A- UK Branch

Central Road, Dartford, DA1 5LR, United Kingdom

 

CATALOGUE 1 THAM KHẢO: 

kimhung.vn Murex HIV Ag-Ab Combination (Murex Diasorin) 1

 

CATALOGUE 2 THAM KHẢO:

kimhung.vn Murex HIV Ag-Ab Combination (Murex Diasorin) 2

 

CATALOGUE 3 THAM KHẢO:

kimhung.vn Murex HIV Ag-Ab Combination (Murex Diasorin) 4

About the author: KIM HƯNG MEDICAL